EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

发布时间：2017-05-05 14:18

  本文关键词：EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：研究EV71病毒及其2A蛋白酶对核孔蛋白P62的影响，从而影响核孔复合物的核转运的功能。研究方法：构建带有核定位信号（NLS）的绿色荧光蛋白载体（pGFP-NLS），将此表达载体转染RD细胞24h后，用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分别感染细胞，8h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的定位情况；将EV71的2A蛋白酶的真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞，转染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的定位情况；用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分别感染RD细胞，8h后收集细胞，裂解细胞后进行Nup62的western blotting检测，同时提取细胞的RNA，逆转录，用EV71-2A的引物进行PCR扩增验证；将2A蛋白酶真核表达载体转染RD细胞，在转染24h、36h和48h后分别收集细胞，裂解细胞后进行Nup62的western blotting检测，同时提取细胞的RNA，，逆转录，用EV71-2A的引物进行PCR扩增验证。结果：转染pGFP-NLS载体24h后，用病毒感染8h，由于病毒阻止了绿色荧光蛋白GFP-NLS的核转移，显微镜下观察到使绿色荧光蛋白表达出现滞留于细胞浆中的现象，而未感染病毒的细胞中绿色荧光蛋白表达于细胞核中；将2A蛋白酶的真核表达载体与pGFP-NLS共转染48h后，显微镜下观察到绿色荧光蛋白滞留在细胞浆中，而未转染2A蛋白酶的对照孔内绿色荧光蛋白表达于细胞核内；不同滴度的EV71病毒感染细胞后的western blotting检测到病毒感染的RD细胞中Nup62蛋白的表达下降，并且下降具有病毒毒力依赖性，即随着病毒毒力的增强蛋白表达量随之下降，而且100TCID50的病毒感染导致细胞中的Nup62出现明显的被切割条带，2A的RT-PCR结果也显示出病毒能够在细胞中复制；转染2A蛋白酶分不同时间收集细胞后的western blotting检测到细胞中的Nup62表达下降，其中在48h时最为明显，RT-PCR结果发现2A的表达具有时间依赖性，随着转染时间的延长，mRNA的表达增加，反映2A蛋白酶的表达也增加。结论：本研究证明EV71病毒可通过2A蛋白酶切割核孔蛋白p62，使核孔复合物的结构受到破坏，从而影响其核转运的功能。
【关键词】：肠道病毒71型 Nup62 核转运 2A
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.2
【目录】：

• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-7
• 前言7-9
• 1. 材料与方法9-24
• 2. 结果24-33
• 3. 讨论33-35
• 4. 结论35-36
• 参考文献36-40
• 文献综述40-51
• 参考文献46-51
• 注释和说明清单51-52
• 攻读学位期间发表文章情况52-53
• 致谢53-54
• 作者简介54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：346513