shR-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞向神经干细胞定向分化

发布时间：2017-05-07 05:47

  本文关键词：shR-377联合细胞因子诱导人脂肪间充质干细胞向神经干细胞定向分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：（1）建立体外分离培养人脂肪间充质干细胞(HADMSCs)的方法。（2）探索shR-377联合细胞因子诱导HADMSCs向神经干细胞（NSCs）定向分化。 方法：（1）采用吸脂术获取健康青年人腹部大网膜脂肪组织，胶原酶消化法分离HADMSCs，用含有2ng/ml FGF-b和5%FBS的DMEMF12（1:1）培养基体外持续传代培养，并观察有无分化，对第三代HADMSCs进行表型鉴定。（2）取第三代HADMSCs，用shR-377转染2次，，第一次转染后加入含有FGF-b、BMP4、B27、activinA的DMEMF12（1:1）培养基，第二次转染后加入含有IGF-1、EGF、SCF、FGF-b因子的DMEMF12（1:1）培养基。每日观察细胞形态变化。（3）取诱导后第1日的细胞用流式细胞仪检测NSCs标志物神经巢蛋白(nestin)表达率，取诱导后第3日的细胞进行RT-qPCR和免疫细胞化学测定nestin和神经特异性RNA结合蛋白musashi，并对转化后细胞的分化能力进行分析。 结果：（1）从形态学观察HADMSCs体外连续培养20代未见明显分化。（2）诱导后第1日细胞形态明显发生变化，大部分细胞伪足收缩变细呈单极或多极延长，细胞核膨胀隆起，类似蝌蚪形。第3日约一半细胞聚集形成神经干样细胞球，第7日绝大部分细胞聚集成神经干样细胞球。（3）诱导后第1日的细胞用流式细胞仪测定nestin表达率为（64.6±3.2%），诱导后第3日神经干样细胞球RT-qPCR检测结果显示nestin、musashi表达阳性，免疫细胞化学染色见nestin表达阳性。神经干样细胞球进一步分化培养，可见到很明显的细长突触，双极或多极神经元样形态，进行RT-qPCR检测显示GFAP、NSE、核受体相关因子1(NURR1)表达阳性，免疫细胞化学染色见NSE、GFAP表达阳性。 结论：(1)采用胶原酶消化和含2ng/ml FGF-b、5%FBS的DMEMF12（1:1）培养基成功建立体外分离培养HADMSCs方法。(2)shR-377联合细胞因子的诱导方法可以使HADMSCs定向分化为NSCs，诱导时间为48h，转化率为（64.6±3.2%）。转化时间和转化率比传统方法有较大提高，为体外大量获得NSCs提供了实验依据。
【关键词】：shR-377 人脂肪间充质干细胞 诱导 神经干细胞 定向分化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英缩略词表8-9
• 第1章 前言9-12
• 第2章 材料与方法12-23
• 2.1 实验仪器12-13
• 2.2 试剂13-14
• 2.3 HADMSCs 分离培养及鉴定14-16
• 2.3.1 HADMSCs 的分离培养14
• 2.3.2 HADMSCs 的传代培养14
• 2.3.3 细胞冻存与复苏14-15
• 2.3.4 HADMSCs 形态学观察15
• 2.3.5 HADMSCs 的表型鉴定15-16
• 2.4 shR-377 联合细胞因子诱导 HADMSCs 向 NSCs 定向分化16-17
• 2.4.1 细胞转染16
• 2.4.2 诱导实验16-17
• 2.5 诱导后 NSCs 的鉴定与分化17-22
• 2.5.1 流式细胞检测诱导后细胞 nestin 及转化率17-18
• 2.5.2 RT-qPCR 检测诱导后细胞 nestin 和 musashi18-21
• 2.5.3 免疫细胞化学检测诱导后细胞 nestin21
• 2.5.4 诱导后 NSCs 分化培养及分化后神经细胞的鉴定21-22
• 2.6 统计方法22-23
• 第3章 结果23-33
• 3.1 HADMSCs 的分离培养与鉴定23-25
• 3.1.1 HADMSCs 形态学特征23-24
• 3.1.2 HADMSCs 的表型鉴定24-25
• 3.2 shR-377 联合细胞因子诱导 HADMSCs 向 NSCs 定向分化25-27
• 3.2.1 shR-377 转染 HADMSCs 的转染效果25-26
• 3.2.2 HADMSCs 向 NSCs 定向分化的形态变化26-27
• 3.3 诱导后 NSCs 的鉴定与分化27-33
• 3.3.1 流式细胞仪检测诱导后细胞 nestin 及转化率27-28
• 3.3.2 RT-qPCR 检测诱导后细胞 nestin 和 musashi28-29
• 3.3.3 免疫细胞化学检测诱导后细胞 nestin29-30
• 3.3.4 诱导后 NSCs 进一步向神经细胞分化形态观察30
• 3.3.5 RT-qPCR 检测分化后神经细胞 NSE、GFAP 和 NURR130-32
• 3.3.6 免疫细胞化学检测分化后神经细胞 NSE 和 GFAP32-33
• 第4章 讨论33-36
• 第5章 结论36-37
• 致谢37-38
• 参考文献38-41
• 综述41-49
• 参考文献46-49

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本文编号：349260