大肠杆菌O157:H7毒力蛋白NleB1,NleB2对NF-κB信号通路的影响

发布时间：2017-05-11 07:09

  本文关键词：大肠杆菌O157:H7毒力蛋白NleB1,NleB2对NF-κB信号通路的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肠出血性大肠杆菌0157：H7是一种危害严重的肠道致病菌,0157：H7属于胞外菌,主要利用Ⅲ型分泌系统(T3SS)将毒力蛋白直接注入宿主细胞内,通过影响宿主细胞的各项生理功能,如改变细胞代谢情况、调节免疫应答、影响细胞内信号通路等,从而达到侵染宿主的目的。目前,利用生物信息学的方法分析EHEC O157:H7存在62个毒力蛋白,经实验验证的有39个,其中NleE, NleC,N1eH等毒力蛋白的致病机制研究的比较透彻,它们分别通过在不同程度上影响宿主体内的NF-κB、MAPK、泛素、细胞凋亡等信号通路,从而产生致病性,然而对于EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的研究还处于初始阶段,研究其致病机制对于探索O157：H7的致病性具有深远意义。 肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB存在两个家族成员：NleB1、NleB2(其中NleB1是经实验验证的毒力蛋白,NleB2未经实验验证),而且经实验证实都是可以转录和表达的。与EHEC亲缘关系相近的肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli; EPEC)和柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)只含有一个NleB毒力蛋白,C. rodentium的毒力蛋白NleB具有N-乙酰葡糖胺转移酶活性,它可以对GAPDH进行0连接的N乙酰葡糖胺糖基化修饰,从而破坏了GAPDH与TRAF2的相互作用,进而抑制了TRAF2的多聚泛素化和NF-κB的活性。 经基因序列比对,发现肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB1与柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)的NleB碱基序列相似度为89%,这为我们进一步探讨O157：H7的毒力蛋白NleB1、NleB2对NF-κB信号通路的作用及作用机制奠定了基础。 利用Real-time PCR方法对nleB1和nleB2转录水平评价分析,证明了nleB1和nleB2在天然菌株中都可以转录,且NleB2的表达量是NleB1的约0.0076倍,差异显著。 为了进一步深入探讨EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的功能和致病机制,我们利用λRed重组法构建了nleB1, nleB2基因敲除株。毒力评价分析得出：敲除株与野生株相比,在LB培养基中的生长速度无显著变化,在DMEM培养基中生长速度要快；基因敲除前后对HeLa粘附细胞数目无显著的影响；利用野生株和敲除株侵染HeLα细胞,用TNF-α刺激,ELISA检测IL-8的水平,发现敲除后IL-8的表达水平上调。 通过构建pAcGFP-nleBl, pAcGFP-nleB2,检测nleBl, nleB2对NF-κB信号通路的影响,发现nleBl, nleB2均可以抑制TNF-α激活的NF-κB信号通路,但是对IL-1p激活的NF-κB信号通路无抑制作用。 本研究构建了nleB1, nleB2基因敲除株,并对其进行了初步的毒力评价分析,通过双荧光检测系统证明了nleB1, nleB2对TNF-α激活的NF-κB信号通路有抑制作用,但是对IL-1β激活的NF-κB信号通路无抑制作用。以上实验为下一步研究NleB1、 NleB2蛋白的功能,以及阐明肠出血性大肠杆菌O157：H7的致病机制奠定了基础。
【关键词】：肠出血性大肠杆菌 O157:H7 Ⅲ型分泌系统 NleB基因敲除 NF-κB
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.21
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 缩略词表10-12
• 引言12-19
• 第一章 nleB1、nleB2转录水平的评价分析19-23
• 1 实验材料19
• 1.1 实验试剂19
• 1.2 实验仪器19
• 2 实验方法19-21
• 2.1 实时定量PCR引物设计19
• 2.2 总RNA的提取19-20
• 2.3 cDNA链的合成20
• 2.4 实时定量PCR20-21
• 3 实验结果21-22
• 3.1 RNA提取结果21
• 3.2 实时定量PCR结果21-22
• 4 讨论22-23
• 第二章 nleB1,nleB2基因敲除株的构建23-37
• 1 实验材料23-24
• 1.1 主要实验试剂23
• 1.2 溶剂配制23
• 1.3 主要的仪器设备23-24
• 2 实验方法24-31
• 2.1 nleB1,nleB2基因敲除引物的设计24-25
• 2.2 制备敲除nleB1,nleB2的同源重组片段25-29
• 2.3 EHECO157：H7/pKD46感受态细胞的制备29-30
• 2.4 同源重组片段点击转化EHEC O157:H7/pKD46感受态细胞30
• 2.5 鉴定EHEC O157：H7△nleB1：：kan、EHEC O157：H7△nleB2：：kan菌株30-31
• 3 结果与分析31-36
• 3.1 基因nleB1上、下游同源臂及Kan片段的制备31-32
• 3.2 基因nleB1同源重组片段的制备32
• 3.3 连接T载体后的酶切获得同源重组片段32-33
• 3.4 nleB1同源重组片段的大量制备33
• 3.5 鉴定EHEC O157：H7 AnleB1：：Kan菌株33-34
• 3.6 nleB2上、下游同源臂及Kan片段的制备34
• 3.7 nleB2同源重组片段的制备34-35
• 3.8 基因nleB2同源重组片段的大量制备35
• 3.9 鉴定EHEC O157：H7△nleB2：：Kan菌株35-36
• 4 小结与讨论36-37
• 第三章 肠出血性大肠杆菌O157：H7 AnleB1/nleB2毒力评价37-44
• 1 实验材料37-38
• 1.1 主要试剂37
• 1.2 主要溶液配制37
• 1.3 主要仪器37-38
• 2 实验方法38-40
• 2.1 肠出血性大肠杆菌O157：H7△nleB1和△nleB2在不同培养基中的生长状态38
• 2.2 肠出血性大肠 O157：H7 △nleB1和△nleB2对粘附细胞数目的影响38-39
• 2.3 敲除前后对IL-8表达的影响39-40
• 3 结果40-43
• 3.1 肠出血性大肠杆菌O157：H7△nleB1和△nleB2在不同培养基中的生长状态40-42
• 3.2 肠出血性大肠杆菌O157：H7 △nleB1和△nleB2对粘附细胞数目的影响42
• 3.3 肠出血性大肠杆菌O157：H7野生株、△nleB1和△nleB2对IL-8表达的影响42-43
• 4 讨论43-44
• 第四章 nleB1,nleB2对NF-κB信号通路的影响44-53
• 1 实验材料44
• 1.1 实验试剂44
• 1.2 溶液的配制44
• 1.3 主要的仪器设备44
• 2 实验方法44-50
• 2.1 重组表达载体的构建策略44-45
• 2.2 PCR扩增nleB1,nleB2基因45
• 2.3 pMD19-T-nleB1,pMD19-T-nleB2载体的构建45-47
• 2.4 pAcGFP-nleB1,pAcGFP-nleB2载体的构建47-49
• 2.5 nleB1,nleB2对NF-κB信号通路的影响49-50
• 3 实验结果50-52
• 3.1 原核表达载体pAcGFP-nleB1,pAeGFP-nleB2的构建和鉴定50-51
• 3.2 pAcGFP/pAcGFP-nleB1/pAcGFP-nleB2,pNF-KB-luc,pRL-TK转染至293细胞51
• 3.3 nleB1,nleB2对NF-κB信号通路的影响51-52
• 4 讨论52-53
• 全文总结53-54
• 1 本实验主要的研究结果53
• 2 论文的创新点53
• 3 下一步计划53-54
• 参考文献54-57
• 致谢57-59
• 发表的学术论文目录59

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