用番茄（Solanum lycopersicum）表达口服Norovirus亚单位疫苗

发布时间：2017-05-11 11:14

  本文关键词：用番茄（Solanum lycopersicum）表达口服Norovirus亚单位疫苗，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：诺如病毒(Norovirus, NVs)是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要病原,为一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒,属于杯状病毒科(Human Calicivirus, HuCV)诺如病毒属(Norovirus, NV)的原型代表株。该病毒可以感染各年龄阶段的人群,感染力仅次于轮状病毒,在人群密集场所易发生聚集性爆发,病情难以控制。目前临床上尚无特效的抗病毒药物来治疗由该病毒引起的感染,主要以对症或支持治疗为主。近年来,该病毒时有大规模爆发,疫苗己成为NVs预防和疫情爆发的重要手段,病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)也成为该领域研制的热点。研究发现,NVs的衣壳蛋白P粒子与人组织血型抗原(Histo-blood group antigen, HBGA)特异亲和能力远远强于其VLPs,而P粒子作为亚基疫苗的研究鲜见报道。因此,利用植物系统表达P粒子可食性疫苗有望成为预防NVs传染和爆发的有效手段。本研究按照番茄(Solanum lycopersicum)偏爱密码子设计和合成了编码VA387毒株衣壳蛋白P粒子的基因(.P(GENE),在其5’端引入编码His-tag (6×His)的DNA序列,并将PGl ENE置于E8动子下游,构建E8::PGENE表达载体,通过农杆菌介导法转化番茄下胚轴诱导植株再生。同时,构建含PGENE原核表达载体：pET32a-PGENE,并转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下快速表达和纯化P粒子,作为研究番茄表达口服NVs亚基疫苗的参照。对277株卡那霉素抗性植株PCRSouthern blotting分析,确认获得了14株整合有PGENE番茄植株；通过RT-PCR开Western blotting分析,确认了PGENE在转基因番茄果实中成功表达,靶蛋白表达量占总可溶蛋白的0.22%；在透射电镜下确认了真核(番茄)和原核(大肠杆菌)表达的P粒子聚合了球形；小鼠免疫实验显示,在2个表达系统中所表达的P粒子均可以获得有活性的抗血清。该研究为用番茄表达口服NVs疫苗的研究作了必要的准备。
【关键词】：诺如病毒 P粒子 番茄 大肠杆菌 免疫原性
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 英文缩写词表15-18
• 第一章 文章综述18-44
• 1.1 背景介绍18-20
• 1.1.1 病原学特征18-19
• 1.1.2 Norovirus的基因型分类19-20
• 1.2 Norovirus流行病学特征20-25
• 1.2.1 传播概况20
• 1.2.2 传染源、传播方式和宿主易感性20-22
• 1.2.3 临床症状22
• 1.2.4 临床诊断治疗和预防措施22
• 1.2.5 实验室检测手段22-25
• 1.2.5.1 电镜法23
• 1.2.5.2 免疫法23-24
• 1.2.5.3 分子生物学方法24-25
• 1.3 Norovirus基因组结构特征25-31
• 1.3.1 Norovirus衣壳蛋白和VLPs26
• 1.3.2 P二聚体和P粒子26-28
• 1.3.3 Norovirus与HBGA之间的反应模型28-31
• 1.4 Norovirus疫苗研究进展31-33
• 1.5 植物可食性疫苗表达系统33-41
• 1.5.1 植物可食疫苗33-34
• 1.5.2 植物表达系统的分类34-36
• 1.5.2.1 稳定整合系统34-35
• 1.5.2.2 瞬时整合系统35-36
• 1.5.3 植物可食性疫苗优势36
• 1.5.4 植物可食疫苗的研究现状36-38
• 1.5.5 植物生产可食性疫苗瓶颈和解决策略38-41
• 1.5.5.1 外源蛋白表达量低，免疫剂量不确定39
• 1.5.5.2 服时活性易受影响39-40
• 1.5.5.3 植物疫苗生物安全性问题40-41
• 1.6 番茄受体表达系统的选择41-44
• 1.6.1 受体植株的选择41
• 1.6.2 番茄是较理想的.服疫苗生产受体植物41-42
• 1.6.3 本研究的目的和意义42-44
• 第二章 用大肠杆菌（ E scher ichia c oli）表达N V疫苗44-75
• 2.1 实验材料44-48
• 2.1.1 菌株和载体44
• 2.1.2 药品44-45
• 2.1.3 试剂耗材45-46
• 2.1.4 试剂盒46
• 2.1.5 主要仪器设备46-47
• 2.1.6 引物序列47-48
• 2.2 载体构建48-56
• 2.2.1 基因合成48-49
• 2.2.2 构建表达载体49-54
• 2.2.2.1 构建流程如图50
• 2.2.2.2 质粒抽提50-51
• 2.2.2.3 酶切51-52
• 2.2.2.4 产物胶回收52-53
• 2.2.2.5 回收产物连接53
• 2.2.2.6 大肠杆菌（DH5α）感受态细胞制备（CaCl2法）53-54
• 2.2.3 热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞54
• 2.2.4 阳性克隆载体的检测和确定54-56
• 2.2.4.1 PCR检测初步确定阳性克隆54-56
• 2.2.4.2 测序确定阳性克隆载体56
• 2.2.5 载体转化大肠杆菌BL2156
• 2.3 P粒子诱导表达及蛋白检测56-63
• 2.3.1 P粒子温度梯度和时间梯度诱导56
• 2.3.2 SDS-PAGE分离检测蛋白56-58
• 2.3.3 P粒子Western Blotting分析58-60
• 2.3.4 外源蛋白的可溶性分析60
• 2.3.5 目的蛋白P粒子的纯化60-62
• 2.3.6 纯化目的蛋白浓度测定62-63
• 2.4 透射电镜观察P粒子形态63
• 2.5 实验结果与分析63-73
• 2.5.1 原核表达载体的构建63-65
• 2.5.2 重组质粒转化和检测65-66
• 2.5.3 P粒子诱导表达及western blotting检测66-69
• 2.5.4 目的蛋白可溶性的分析69-70
• 2.5.5 目的蛋白纯化70-71
• 2.5.6 目的蛋白浓度测定71-72
• 2.5.7 电镜观察P粒子形态72-73
• 2.6 实验小结73-75
• 第三章 No rovir us P粒子在番茄中表达75-121
• 3.1 材料和试剂75-79
• 3.1.1 菌株和植物材料75
• 3.1.2 载体75-76
• 3.1.3 寡核苷酸引物76-77
• 3.1.4 试剂和耗材77-78
• 3.1.5 试剂盒78-79
• 3.1.6 主要仪器设备79
• 3.2 实验方法79-101
• 3.2.1 技术路线79-80
• 3.2.2 E8::PGENE载体构建80-83
• 3.2.2.1 构建思路80
• 3.2.2.2 质粒提取80
• 3.2.2.3 酶切80-82
• 3.2.2.4 感受态细胞的制备和转化DH5α82
• 3.2.2.5 阳性克隆载体的检测和确定82-83
• 3.2.3 P粒子在番茄细胞中表达83-85
• 3.2.3.1、根癌农杆菌感受态的制备83-84
• 3.2.3.2 番茄的遗传转化84-85
• 3.2.4 再生番茄植株阳性筛选85-94
• 3.2.4.1 番茄植株的PCR检测85-87
• 3.2.4.2 转基因抗性植株的Southern blotting检测分析87-94
• 3.2.5 RT-qPCR检测转录水平表达量94-98
• 3.2.5.1 转基因抗性番茄RNA提取94-96
• 3.2.5.2 反转录成为cDNA96
• 3.2.5.3 转基因mRNA的荧光定量PCR检测96-98
• 3.2.6 PGENE在番茄果实中表达蛋白的分析98-101
• 3.2.6.1 抗性番茄果实总蛋白提取（冰浴）98
• 3.2.6.2 抗性番茄果实可溶蛋白SDS-PAGE胶 和Western blotting检测98-99
• 3.2.6.3 可溶性总蛋白浓度测定99-101
• 3.2.7 P粒子电镜观察101
• 3.3 实验结果分析101-120
• 3.3.1 E8::PGENE载体构建101-103
• 3.3.2 大肠杆菌PCR检测和测序结果103-104
• 3.3.3 E8::PGENE转化农杆菌检测结果104-105
• 3.3.4 获得带有目的基因的再生番茄阳性株105-106
• 3.3.5 再生番茄抗性筛选106-109
• 3.3.6 阳性植株的Southern blotting分析结果109-111
• 3.3.7 RT-qPCR检测转录水平表达量111-114
• 3.3.8 PGENE蛋白在果实中特异表达分析114-116
• 3.3.9 转基因抗性番茄果实可溶性总蛋白浓度的测定116-117
• 3.3.10 转基因抗性番茄果实特异性蛋白浓度的测定117-119
• 3.3.11 透射电镜观察植株表达P粒子形态119-120
• 3.4 小结120-121
• 第四章 番茄果实动物免疫试验121-136
• 4.1 实验材料121-122
• 4.1.1 实验样品及实验动物121
• 4.1.2 主要试剂121-122
• 4.1.3 主要仪器及耗材122
• 4.2 实验方法122-128
• 4.2.1 基础实验操作及技术路线122-123
• 4.2.2 免疫原的制备123-124
• 4.2.2.1 原核表达的蛋白免疫原制备123
• 4.2.2.2 番茄植株表达的蛋白免疫原制备123-124
• 4.2.3 小鼠抗血清的制备124-125
• 4.2.4 小鼠血清质量检测125-127
• 4.2.4.1 目的蛋白与抗血清最佳反应浓度检测125-127
• 4.2.4.2 血清的效价检测127
• 4.2.5 Western Blotting验证免疫功能（特异性）127-128
• 4.3 结果128-134
• 4.3.1 靶蛋白与抗血清最佳反应浓度128
• 4.3.2 抗血清效价检测128-130
• 4.3.3 靶蛋白免疫功能验证（特异性）130-134
• 4.3.3.1 pET32a-PGENE表达的靶蛋白的免疫原性检测（原核血清vs原核抗原）130-132
• 4.3.3.2 原核表达蛋白生物学活性检测（原核血清vs植株抗原132-133
• 4.3.3.3 植物表达系统产生的靶蛋白功能检测 （ 植株免疫血清VS原核和植株抗原和真核抗原）133-134
• 4.4 小结134-136
• 第五章 讨论与展望136-141
• 5.1 讨论136-137
• 5.1.1 用大肠杆菌表达Norovirus亚基疫苗136
• 5.1.2 用番茄表达Norovirus亚基疫苗136-137
• 5.1.3 动物免疫实验137
• 5.1.3.1 原核表达蛋白免疫血清的获得137
• 5.1.3.2 番茄植株表达外源蛋白免疫血清的获得137
• 5.2 结论137-138
• 5.3 创新点与不足138-139
• 5.3.1 创新点138-139
• 5.3.2 遇到的困难与不足139
• 5.4 后续工作139-141
• 附录141-143
• 参考文献143-157
• 致谢157-159
• 硕士学位期间已发表或录用的专利和论文159

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