ACT和ICL基因在隐球菌抗饥饿反应中的作用

发布时间：2017-05-11 21:11

  本文关键词：ACT和ICL基因在隐球菌抗饥饿反应中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是一种重要的人体条件致病性真菌,主要感染艾滋病患者以及长期接受大量固醇类药物治疗的病人,是临床上真菌性脑膜炎的主要病原菌。隐球菌(新型隐球酵母)可以在细胞免疫受损人体的巨噬细胞中长期潜伏并最终复活和繁殖,扩散至大脑,导致隐球性脑膜炎等中枢神经系统疾病。已有的研究表明VPS41基因在隐球菌的体外抗饥饿反应、巨噬细胞中的存活及致病性中起关键作用。为了鉴定参与VPS41抗饥饿反应信号通路的相关成员,本课题利用数字基因表达谱确定在氮源饥饿条件下隐球酵母野生型菌株H99与VPS41基因功能缺失突变株vps41△中转录表达呈显著差异的基因。对其中的2个表达水平显著下调的基因ACT(乙酰转移酶基因)和ICL(异柠檬酸裂合酶基因)进行了基因定向敲除,获得了隐球酵母ACT缺陷型act△、ICL缺陷型iclA重组菌,并构建了功能回补菌株act△::ACT、 icl△::ICL。体外48 h氮源饥饿试验结果显示：(1)野生型H99、突变株actA、回补菌株act△::ACT的存活率分别为86.93%、4.52%、59.92%；(2)突变株icl△、回补菌株icl△::ICL的存活率分别为5.76%、76.90%。以上结果表明ACT和ICL基因在隐球菌的体外抗饥饿反应中具有重要的作用。利用qRT-PCR研究了ACT, ICL的表达水平与VPS41功能的潜在关系,发现VPS41缺陷导致ACT、ICL的表达水平的显著降低,表明乙酰转移酶(ACT)、异柠檬酸裂合酶(ICL)不仅参与隐球酵母的体外抗饥饿反应,影响饥饿环境下的生存率,并且其表达水平受到VPS41饥饿信号通路的调控。以上研究结果为进一步了解VPS41基因调控隐球菌饥饿应答反应的分子机制,鉴定饥饿信号通路中的其他关键基因奠定了基础。
【关键词】：新型隐球酵母 饥饿反应 乙酰转移酶 异柠檬酸裂合酶
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R379
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-19
• 1.1 新型隐球酵母的概述8-10
• 1.1.1 新型隐球酵母的分类和分布8
• 1.1.2 新型隐球菌致病途径8-10
• 1.2 新型隐球酵母致病因子10-13
• 1.2.1 荚膜10-11
• 1.2.2 具有37℃条件下的生存能力11-12
• 1.2.3 漆酶12
• 1.2.4 抗饥饿反应因子12-13
• 1.3 饥饿反应信号通路13-15
• 1.3.1 细胞对营养饥饿的感应和应答13-14
• 1.3.2 TOR信号转导途径14
• 1.3.3 新型隐球酵母的氮源饥饿14-15
• 1.4 数字基因表达谱15-16
• 1.5 乙酰转移酶基因(ACT)和异柠檬酸裂合酶基因(ICL)16-17
• 1.6 验证基因功能的策略17
• 1.7 本论文的研究内容及意义17-19
• 1.7.1 研究内容17-18
• 1.7.2 研究意义18-19
• 2 材料与方法19-41
• 2.1 材料19-27
• 2.1.1 菌种与质粒19
• 2.1.2 工具酶及相关试剂19-22
• 2.1.3 主要仪器和设备22-23
• 2.1.4 引物23-24
• 2.1.5 培养基及培养条件24-25
• 2.1.6 主要溶液25-27
• 2.2 方法27-41
• 2.2.1 ACT、ICL在vps41△中恢复表达27
• 2.2.2 vps41△：：ACT、vps41△：：ICL菌株中ACT、ICL的表达水平分析27-29
• 2.2.3 敲除载体pKH-ACT和pKH-ICL的构建29-34
• 2.2.4 电转化法分别敲除WT菌株的ACT和ICL34-37
• 2.2.5 回补载体pKU-ACT和pKU-ICL的构建37-38
• 2.2.6 5-氟乳清酸对敲除突变株的诱导38
• 2.2.7 电转化法回补act△和icl△38-39
• 2.2.8 敲除突变株与回补菌株的抗饥饿能力的检测39
• 2.2.9 荧光定量PCR分别检测ACT和ICL的表达水平39-40
• 2.2.10 待测菌株在小鼠(BALB/c)模型中致病能力的检测40-41
• 3 结果与讨论41-61
• 3.1 组成型表达ACT、ICL对vps41△抗饥饿能力的影响41
• 3.2 荧光定量PCR分别检测ACT、ICL的表达水平41-43
• 3.2.1 TRIZOL试剂法提取RNA42-43
• 3.2.2 荧光定量PCR验证43
• 3.3 敲除载体pKH-ACT和pKH-ICL的构建43-46
• 3.3.1 PCR扩增敲除载体的左臂、右臂43-44
• 3.3.2 HYG片段和载体骨架pBlue KS的酶切44-45
• 3.3.3 敲除载体的构建45-46
• 3.4 敲除突变株的筛选与验证46-48
• 3.4.1 敲除突变株的筛选46-47
• 3.4.2 敲除突变株的验证47-48
• 3.5 回补载体pKU-ACT和pKU-ICL的构建48-51
• 3.5.1 URA5及载体骨架的获取49
• 3.5.2 回补载体的构建49-51
• 3.6 回补菌株的筛选与鉴定51-53
• 3.6.1 5-氟乳清酸对敲除突变株的诱导51-52
• 3.6.2 回补菌株的筛选与验证52-53
• 3.7 待测菌株抗饥饿能力的检测53-55
• 3.8 突变株和回补突变株的基因表达水平分析55-57
• 3.8.1 TRIZOL试剂法提取RNA55-56
• 3.8.2 act△和act△：：ACT中ACT基因的表达水平分析56
• 3.8.3 icl△和icl△：：ICL中ICL基因的表达水平分析56-57
• 3.9 探索ACT、ICL与VPS41之间的联系57-59
• 3.9.1 检测经饥饿诱导后vps41△和vps41△：：VPS41中ACT基因的表达水平57-58
• 3.9.2 检测经饥饿诱导后vps41△和vps41△：：VPS41中ICL基因的表达水平58-59
• 3.10 待测菌株在小鼠(BALB/c)模型中致病能力的检测59-61
• 4 结论61-62
• 5 展望62-63
• 6 参考文献63-69
• 7 攻读硕士学位期间发表的论文69-70
• 8 致谢70

【共引文献】

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1 林旎;欧启水;;新型隐球菌毒力相关因子及其研究进展[J];国际检验医学杂志;2008年04期

2 侯丽颖;孙燕佩;张旭光;赵栋;吴坤;;维生素E琥珀酸酯通过Akt/mTOR信号通路诱导人胃癌细胞SGC-7901发生保护性自噬[J];癌变.畸变.突变;2013年05期

3 陈松峰;邵增务;;自噬相关信号转导通路研究进展[J];国际骨科学杂志;2013年04期

4 Jun Cheng;Min Quan;Liang Wu;Qi Wang;;The Role of Autophagy in Hepatitis C Virus Infection[J];Infection International(Electronic Edition);2012年01期

5 王路乔;黄波;程晓曙;;细胞自噬在心血管应激和心脏疾病中的作用[J];广东医学;2013年19期

6 李霞;黄文娟;朱素菲;陈维贤;;雷帕霉素诱导细胞自噬促进乙型肝炎病毒的复制[J];第三军医大学学报;2014年12期

7 阿布都热合曼·阿布力米提;布佐日古丽·喀迪尔;吾甫尔·米吉提;;灵菌红素及其应用的研究进展[J];安徽农业科学;2015年09期

8 苏鑫;王春虾;王素华;郑姗姗;刘建国;余艳琴;;细胞自噬在砷暴露所致肺损伤中的作用[J];环境卫生学杂志;2015年04期

9 吴媛;李文革;卢金星;;143份鸽粪中酵母菌的分离鉴定[J];疾病监测;2011年02期

10 邹先彪;廖万清;温海;吴建华;仇芸;杨金水;;新生隐球菌5种血清型的CAP64基因的序列分析[J];检验医学与临床;2010年11期

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1 杨爱民;Neuronostatin对痛觉、胃肠运动和情绪的影响及脂基化蛋白LC3-Ⅱ的半合成[D];兰州大学;2013年

2 刘峗;调控镊钴基纳米材料及纳米基因载体的自噬效应在肿瘤诊疗中的应用[D];中国科学技术大学;2013年

3 安涛;NRG-1保护阿霉素所致心肌细胞损伤的机制研究[D];北京协和医学院;2013年

4 张伟;NO/cGMP信号通路在新生和未成熟雌性大鼠卵泡形成和发育中的生物学作用及其调控机制研究[D];南京农业大学;2011年

5 孙英杰;细胞自噬在新城疫病毒感染过程中的作用[D];中国农业科学院;2013年

6 张学农;化合物RY10-4部分作用机制及抗肿瘤活性的研究[D];华中科技大学;2013年

7 张俊;自噬在肺缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究[D];华中科技大学;2013年

8 黄锐;Sirt1调控核内LC3脱乙酰化在自噬中的作用研究[D];浙江大学;2013年

9 华雯;雷帕霉素与细胞自噬在哮喘气道炎症和嗜酸粒细胞分化中的作用研究[D];浙江大学;2013年

10 王筱冰;低强度聚焦超声结合原卟啉IX诱导肿瘤细胞不同死亡模式及其机制研究[D];陕西师范大学;2010年

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1 林旎;建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因及临床初步应用[D];福建医科大学;2008年

2 谭伟芬;黑素在马尔尼菲青霉抵抗巨噬细胞吞噬中的作用[D];广西医科大学;2013年

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本文编号：358071