基于慢病毒载体和转录因子的人角膜基质细胞重编程研究

发布时间：2017-05-12 06:06

  本文关键词：基于慢病毒载体和转录因子的人角膜基质细胞重编程研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多能干细胞在再生医学、组织工程和药物发现与评价等领域极具应用价值，科学家们曾尝试通过多种途径获取人的多能干细胞。但是现存方法的广泛应用在技术、细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教或法律等方面存在诸多限制，而iPS细胞能够克服这些问题的限制，被誉为生命科学领域新的里程碑。随着人类对干细胞分化调控机制认识的不断加深，从人的iPS细胞将会衍生出更多种类的人类细胞，，iPS技术将成为细胞替代治疗、新药筛选与评价及其它用途（如提供大量的种子细胞）的基础。 在组织工程人角膜基质的工作中，基质细胞是核心内容之一。人角膜基质细胞在体外培养时有良好的增殖能力，而且能够长期发挥生物学功能。因此，获得数量足够、有再生活力的人角膜基质种子细胞是组织工程开展研究的前提和基础。人角膜基质种子细胞的来源多种，包括异体细胞和自体细胞。在临床应用中，异体细胞容易产生免疫排斥，这极大限制了它的应用。自体细胞获取也有一定的困难：由于体细胞的体外增殖有一定限度，无法从很小的角膜基质组织中获得大量的细胞，而获取大量角膜基质组织又容易对正常角膜的结构和功能造成破坏；其他类型的自体细胞，如骨髓间充质干细胞、皮肤成纤维细胞或脂肪干细胞，亦不能完全替代角膜基质细胞的功能，无法成为组织工程角膜基质理想的种子细胞。 人胚胎干细胞在体外有分化成各种细胞类型的能力，iPS细胞的发明让人们可以从自身体细胞获得大量的、无免疫原性的多能干细胞，因此iPS细胞来源的角膜基质细胞成为了组织工程人角膜基质种子细胞的非常有希望的候选。但是由于人们在人角膜基质细胞分化的分子机制方面缺少足够的研究，导致很难在体外定向地将iPS细胞分化成足够多的、纯净的角膜基质细胞用于临床。最近有大量研究证实iPS细胞带有来源细胞的表观遗传学记忆，iPS细胞基因组中与来源细胞有关联的甲基化组也影响了它们的分化倾向，这一发现启示我们可以充分利用iPS细胞的表观遗传学记忆，来完成那些困难的定向分化。 本文中我们首先对人角膜基质细胞进行了原代培养。将去除上皮和内皮细胞层的人角膜基质进行机械分割，在培养板上进行贴壁培养，后将迁出的角膜基质细胞进行传代培养。体外培养的人角膜基质细胞具有树突状形状特征，核型鉴定发现其染色体具有人类染色体的典型特征，免疫荧光检测表明体外培养的基质细胞均为波形蛋白阳性表达，且不含角膜上皮细胞和角膜内皮细胞。 随后我们用293T细胞以及第二代慢病毒包装质粒系统制作了分别携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种外源性基因的慢病毒，感染效率测定发现当病毒数量与细胞数量之比为10:1时，感染效率超过80%。我们用四种病毒共同感染角膜基质细胞，感染后将细胞消化、接种到预先铺有Matrigel基质胶的培养板上，将培养液换为小鼠胚胎成纤维饲养层条件培养液，开始iPS细胞的诱导。诱导后第三天细胞开始出现了形态的改变，产生大量上皮样及圆形的细胞，诱导后第七天到第九天，培养板中开始出现人胚胎干细胞样的细胞类型，它们的核质比较大，细胞连接紧密，成克隆样生长。诱导第二十天，胚胎干细胞样的细胞团已经非常明显，我们进行了多能性干细胞的功能标志之一，碱性磷酸酶染色，发现培养板中有大量碱性磷酸酶阳性细胞，初步确定已成功诱导人角膜基质细胞成为iPS细胞，诱导效率为0.4%-0.8%。 综上所述，本文将人角膜基质细胞重编程为iPS细胞，赋予角膜基质细胞无限的增殖能力，为获得大量的种子细胞奠定基础。我们希望在不久的将来，在此工作的基础上利用iPS细胞表观遗传学记忆，使大量扩增的角膜基质细胞来源的iPS细胞重新定向分化为角膜基质细胞，满足组织工程对种子细胞的需求。另外我们还可以将此iPS细胞分化为跟角膜基质细胞在发育上关系相近的角膜中其它类型的细胞，比如说角膜内皮细胞和角膜上皮细胞，从而获得这些数量稀少且在体外难于培养的细胞类型，用于疾病治疗或理论研究。
【关键词】：诱导性多能干细胞 人角膜基质细胞 Yamanaka因子 慢病毒 重编程
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q813;R329.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-25
• 1. 发育过程中的多能干细胞13-15
• 1.1 胚胎干细胞13-14
• 1.2 外胚层干细胞14
• 1.3 胚胎生殖细胞和成体生殖系干细胞14-15
• 2. 多能干细胞的分类15-16
• 2.1 两种基本的多能性状态15-16
• 2.2 两种多能性状态的维持和转化16
• 3. 人胚胎干细胞16-19
• 3.1 人胚胎干细胞的多能性状态16-17
• 3.2 人胚胎干细胞在研究中遇到的问题17
• 3.3 核移植技术17-18
• 3.4 诱导性多能干细胞（iPS 细胞）18-19
• 4. 胚胎干细胞与 iPS 细胞的异同19-22
• 4.1 iPS 细胞与胚胎干细胞的多能性基因表达相近19-20
• 4.2 iPS 细胞与胚胎干细胞的功能相似20
• 4.3 iPS 细胞与胚胎干细胞之间存在的差异20-22
• 5. iPS 细胞的表观遗传学记忆22-25
• 第二章 人角膜基质细胞的原代培养与鉴定25-32
• 1. 材料用品25-26
• 1.1 材料25-26
• 1.2 主要仪器26
• 1.3 药品与耗材26
• 1.4 常用溶液26
• 2. 实验方法26-27
• 2.1 人角膜基质细胞的原代培养26
• 2.2 人角膜基质细胞的传代培养26-27
• 2.3 人角膜基质细胞核型分析27
• 2.4 人角膜基质细胞免疫化学检测27
• 3 实验结果27-29
• 3.1 人角膜基质细胞的原代培养27-28
• 3.2 人角膜基质细胞的传代培养28
• 3.3 人角膜基质细胞染色体核型分析28
• 3.4 人角膜基质细胞特征蛋白的免疫化学检测28-29
• 4 讨论29-32
• 第三章 从人角膜基质细胞到诱导性多能干细胞32-44
• 1 材料用品32-33
• 1.1 材料32
• 1.2 药品与耗材32-33
• 1.3 常用溶液配方33
• 2 实验方法33-35
• 2.1 质粒的转化及提取33-34
• 2.2 慢病毒的产生和滴度测定34
• 2.3 慢病毒最佳 MOI 测定34
• 2.4 iPS 细胞的诱导34-35
• 3 实验结果35-40
• 3.1 质粒的提取及酶切鉴定35-36
• 3.2 用 293T 细胞包装慢病毒36-37
• 3.3 用 293T 细胞测量病毒滴度37-38
• 3.4 确定病毒感染人角膜基质细胞的最佳 MOI38-39
• 3.5 人 iPS 细胞的诱导39-40
• 3.6 人 iPS 细胞诱导效率测定40
• 4 讨论40-44
• 参考文献44-49
• 致谢（一）49-50
• 致谢（二）50-51
• 附件51-52

【共引文献】

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