复发性流产绒毛组织中细胞凋亡信号通路的研究

发布时间：2017-05-13 11:01

  本文关键词：复发性流产绒毛组织中细胞凋亡信号通路的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：复发性流产是一种病因复杂并严重危害家庭幸福的疾病。细胞凋亡是自然流产的发生基础。复发性流产病因复杂，主要包括遗传缺陷、解剖异常、内分泌紊乱、免疫因素、感染、血栓及环境因素等。但目前超过50%以上的复发性流产患者不能找到明确病因。TP53可诱导细胞生长阻滞，细胞凋亡，细胞分化以及DNA修复。TP53基因的各种功能主要是通过激活或抑制其下游基因来完成的。TP53蛋白介导其下游基因CDKN1A和BAX是与凋亡相关的重要信号通路。TP53可介导下游效应蛋白CDKN1A的表达，将细胞阻断于G1期，并诱导细胞凋亡。而BAX具有促凋亡的作用，其在TP53的激活下直接启动线粒体相关的凋亡通路。因此本研究以人正常早期妊娠及不明原因自然流产的绒毛组织标本为对象,检测绒毛组织细胞凋亡情况及调节基因TP53和其下游基因CDKN1A、BAX的表达,以探讨细胞凋亡相关蛋白TP53及其下游基因CDKN1A、BAX在复发性流产发病机制中的作用。 方法：选取有复发性流产史患者为实验组，共30例，选取有正常生育史妇女为对照组，共30例。所有入选患者尿液中HCG均呈阳性。入选者均通过负压吸引术获得的绒毛组织。其中一部分绒毛组织冻存于-196℃液氮中，以备PCR实验用。另一部分在室温经10%福尔马林固定过夜后石蜡包埋，切片厚度5μm，贴于涂有APES的载玻片上，以备免疫组化及凋亡染色实验用。 1TP53蛋白的检测 利用免疫组化的方法，以TP53特异性一抗与组织内相关抗原结合，并通过辣根过氧化物酶处理后的即用型二抗与一抗结合将抗原放大，然后借助DAB显色剂将抗原抗体反应部位显示出来，在苏木素对细胞核进行染色后使用中性树胶封片。每个样品选取3个视野（200倍放大）拍照，每个视野照片都使用Photoshop CS5软件计算灰度，然后取3个视野的平均值作为该样品的平均灰度值。 2CDKN1A、BAX mRNA相对表达量的检测 采用实时定量PCR (real-time quantitative PCR)法进行CDKN1A和BAX mRNA相对表达量的检测。绒毛组织提取总RNA，步骤如下：液氮冻存的绒毛组织经液氮研磨后，加入1mL Trizol混匀，取500μL悬液加入200μL氯仿混匀后12000rpm离心15min，取上层清液与等体积异丙醇混匀后12000rpm离心15min，75%乙醇洗涤沉淀后，，沉淀溶解于50μLRNase-free水中。按照逆转录试剂盒（FastQuant RT Kit (With gDNase)，说明书进行逆转录。按照试剂盒（SYBR Premix Ex Taq）说明书配制反应体系。反应程序为：预变性：95℃，30sec；PCR扩增：95℃，3sec；60℃，30sec；84℃，1sec；40个循环，84℃读取荧光。2-△△Ct法计算CDKN1A、BAX mRNA在绒毛组织中的相对表达量。 3细胞凋亡检测 采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）对绒毛细胞进行检测，实验流程按照试剂盒说明书进行操作（DeadEnd Fluorometric TUNEL System）。最后使用SlowFade Gold Antifade Reagentwith DAPI对样品进行封片。在荧光显微镜观察以细胞核内出现绿色颗粒作为阳性细胞，既凋亡细胞。每个样品选取3个视野（100倍放大），每个视野在荧光显微镜下用520nm波长拍照一次（绿色TUNEL），然后用430nm波长拍照一次（蓝紫色DAPI），使用Photoshop CS5将两张照片进行合成。最后使用Image-Pro Plus6.0进行荧光分析。 结果： 1绒毛组织中TP53蛋白的表达 免疫组化结果显示TP53蛋白主要表达于细胞核中，呈黄色或者棕黄色颗粒。TP53蛋白在复发性流产患者的绒毛组织中表达量显著性高于正常绒毛组织。对正常组和实验组绒毛组织标本中TP53蛋白的表达情况进行阳性评定。对照组平均灰度显著高于实验组，两组比较P=0.000，具有统计学意义（P0.05）。 2绒毛组织中CDKN1A和BAX mRNA的表达结果显示与正常组的mRNA水平比较，实验组患者的绒毛组织中CDKN1A mRNA水平显著性上调，两组比较P=0.015具有显著的统计学意义（P0.05）。实验组患者的绒毛组织中BAX mRNA水平显著性高于对照组，两组比较P=0.019差异具有统计学意义（P0.05）。 3绒毛组织的细胞凋亡 TUNEL检测显示对照组和实验组患者的绒毛组织的细胞滋养细胞中均有凋亡细胞出现，但是对照组的凋亡细胞较少，实验组凋亡细胞较多。两组比较P=0.024，差异具有统计学意义（P0.05）。 结论：TP53诱导其信号通路的下游基因CDKN1A和BAX异常表达在复发性流产发生过程中可能起到了重要的作用。TP53介导的细胞凋亡信号通路可能是导致妊娠期妇女出现复发性流产的原因之一。
【关键词】：复发性流产 细胞凋亡 TP53 CDKN1A BAX
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料与方法11-18
• 结果18-20
• 附图20-24
• 附表24-26
• 讨论26-29
• 结论29-30
• 参考文献30-32
• 综述 TP53 及其下游基因 CDKN1A、BAX 与妇科疾病32-43
• 参考文献38-43
• 致谢43-44
• 个人简历44

【引证文献】

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1 闫清雅;寿胎丸对HLA-G免疫信号通路的影响及机制初步研究[D];广州中医药大学;2015年

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本文编号：362340