小鼠骨髓间质干细胞成骨分化及促肾上腺皮质激素的影响

发布时间：2017-05-13 13:22

  本文关键词：小鼠骨髓间质干细胞成骨分化及促肾上腺皮质激素的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 研究小鼠骨髓间质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)成骨分化的机理及促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）对其成骨分化作用的影响。 方法 1.取小鼠骨髓间质干细胞（BMMSCs）D1细胞系，作为研究对象。 2.实验分组： 第一部分：小鼠BMMSCs成骨分化-实验分组 第1组：对照组1：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S）； 第2组：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AscorbicAcid, AA10ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S）； 第3组：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AscorbicAcid, AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S）； 第4组：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S）； 第5组：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AscorbicAcid, AA10ug/ml）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S）; 第6组：低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AscorbicAcid, AA50ug/ml）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S） 第7组:低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S） 第8组:低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA10ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S） 第9组:低糖的细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S） 第10组:对照组2:标准培养液(低糖细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S），BM组) 第11组:对照组2+β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)，成骨OM组 第12组:对照组2+p38MAPK丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 第13组:成骨OM组（β-gp10mM）+p38MAPK丝裂原活化蛋白激酶抑制剂 第14组:对照组2+JNK氨基末端蛋白激酶抑制剂 第15组:成骨OM组（β-gp10mM）+JNK氨基末端蛋白蛋白激酶抑制剂 第16组:对照组2+AKT苏氨酸蛋白激酶抑制剂 第17组:成骨OM组（β-gp10mM）+AKT苏氨酸蛋白激酶抑制剂 第二部分：促肾上腺皮质激素对小鼠BMMSCs成骨分化的影响-实验分组 第1组:对照组：标准培养液(低糖细胞培养基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗坏血酸钠（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg链霉素（P/S），BM组) 第2组:对照组+促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M) 第3组:对照组+促肾上腺皮质激素(ACTH10-9M) 第4组:对照组+β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)，成骨OM组 第5组:成骨OM组+促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M) 第6组:成骨OM组+促肾上腺皮质激素(ACTH10-9M) 3.矿化染色:培养小鼠BMMSCs6-7天后，通过Arlizarin Red(茜素红)染色法评价小鼠BMMSCs骨化程度 4.基因表达:培养小鼠BMMSCs1天、3天、6天，然后萃取不同时间细胞中的RNA，然后采用实时定量荧光PCR技术，定量分析成骨相关基因的表达水平及ACTH对其相关基因水平表达的影响。 5.蛋白质水平:培养小鼠BMMSCs15分钟和60分钟，萃取不同时间细胞中的蛋白质成分，采用蛋白印迹（Western Blotting）技术，分析成骨分化相关基因的蛋白质表达水平;在加有促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M)的成骨培养液中培养小鼠BMMSCs3天和6天后，萃取不同时间点细胞中的蛋白质成分，采用蛋白印迹（Western Blotting）技术，分析促肾上腺皮质激素对其成骨分化相关基因蛋白质水平表达的影响。 结果 1.小鼠BMMSCs成骨分化：培养细胞6-7天后，Alizarin Red(茜素红)染色结果显示：第6组：抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)骨化程度高于第5组抗坏血酸钠（Ascorbic Acid,AA10ug/ml）+β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)和第4组β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)不添加抗坏血酸钠（AscorbicAcid,AA），说明抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA）在小鼠BMMSCs成骨分化过程中有促进的矿化的作用，同时第6组抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)矿化程度明显高于第7组β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM)不添加抗坏血酸钠（Ascorbic Acid, AA）和第9组β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗坏血酸钠（Ascorbic Acid,AA50ug/ml）,说明β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)在成骨分化过程中对成骨的促进作用明显强于β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp1mM);由第10组到第17组结果显示：JNK氨基末端蛋白激酶抑制剂和AKT苏氨酸蛋白激酶抑制剂促进成骨分化，p38MAPK丝裂原活化蛋白激酶抑制剂抑制成骨分化；在相关基因蛋白表达水平，促进成骨的组中15分钟，60分钟的Runx2,p-p38, BSP,p-AKT的表达有明显的改变。 2.促肾上腺皮质激素（ACTH）对小鼠BMMSCs成骨分化的影响：促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M)对矿化有明显的抑制作用，而促肾上腺皮质激素(ACTH10-9M)对矿化作用影响不明显；促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M)对成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受体（MC3R）及血管内皮生长因子（VEGFa）的表达水平具有抑制作用，有统计学意义（P0.05），促肾上腺皮质激素(ACTH10-9M)对成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受体（MC3R）及血管内皮生长因子（VEGFa）的表达水平作用不明显,无统计学意义；而在加有促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M)的组中，，Runx2、BSP和P-P38的蛋白质表达水平有下降的趋势。 结论 1.在小鼠BMMSCs成骨分化过程中，抗坏血酸钠（Ascorbic Acid,AA50ug/ml）和β-甘油磷酸盐(β-glycerophosphate, β-gp10mM)有促进成骨分化作用，包括促进矿化和在基因水平和蛋白水平对成骨特异性转录因子Runx2有明显的促进作用。 2.促肾上腺皮质激素(ACTH10-8M)对小鼠BMMSCs成骨分化有抑制作用，而且在基因水平和蛋白水平对成骨特异性转录因子Runx2有明显的抑制作用。
【关键词】：促肾上腺皮质激素 小鼠骨髓间质干细胞 成骨分化 β-甘油磷酸盐 抗坏血酸钠
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 英文缩略词表13-14
• 引言14-16
• 第一章 小鼠骨髓间质干细胞成骨分化16-28
• 材料与方法16-25
• 结果25-26
• 讨论26-28
• 第二章 促肾上腺皮质激素对小鼠骨髓间质干细成骨分化的影响28-42
• 材料与方法28-39
• 结果39-40
• 讨论40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-45
• 附图45-53
• 综述53-63
• 参考文献60-63
• 个人简历63-65
• 致谢65

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