心肌短暂缺血—再灌注反应基因的筛

发布时间：2022-07-02 11:20

　　短暂的心肌缺血可同时导致两种不同的后果—心肌顿抑和缺血预适应。这两种现象的存在表明,当受到缺血损伤刺激时,心肌可调动自身的内源性保护系统,适应和抵抗损伤。揭示这种内源性保护现象的分子机制,对缺血性心脏病的防治具有重要意义。短暂的心肌缺血-再灌注可以诱导许多具有细胞保护作用的基因表达上调,这些表达上调的基因是心肌内源性保护分子机制的重要组成部分。本文采用大鼠心肌短暂缺血-再灌注动物模型,运用抑制消减杂交方法,构建了大鼠心肌短暂缺血-再灌注诱导表达上调基因的消减cDNA文库。通过反向Northern点杂交从文库中筛选了85个克隆进行测序。通过与GenBank数据库进行序列比对,获得了31个已知基因和18个可能代表新基因的EST片段。从以上所获的差异表达基因中任选5个进行RT-PCR分析,任选两个进行Northern杂交分析,均证实其在缺血-再灌注组心肌组织中表达上调。在所筛到的31个已知基因中,多个基因已有文献报道在心肌缺血-再灌注时表达上调并发挥心肌保护作用,另一些已知基因与心肌缺血-再灌注的关系至今未见报道。筛选得到的18个可能代表新基因的EST片段已在GenBank中登录。对以上已知... 

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

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英文摘要
前言
技术路线
第一章 采用抑制消减杂交技术筛选大鼠心肌短暂缺血-再灌注诱导表达上调的基因
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 实验动物
            1.2 试剂
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暂缺血-再灌注动物模型的建立
            2.2 总 RNA 的提取
            2.3 mRNA 的提取
            2.4 抑制消减杂交
                2.4.1 cDNA 第一链的合成
                2.4.2 cDNA 第二链的合成
                2.4.3 双链cDNA 的 RsaⅠ酶切
                2.4.4 检测子（tester）cDNA 的接头连接
                2.4.5 连接效率的检测
                2.4.6 消减杂交
                2.4.7 抑制性 PCR
                2.4.8 消减效率的检测
                2.4.9 消减cDNA 文库的构建
            2.5 反向 Northern 点杂交初步筛选差异表达基因
            2.6 测序与序列分析
            2.7 RT-PCR 进一步鉴定差异表达
            2.8 Northern blot 进一步鉴定差异表达
    二、 结果
        1. 总 RNA 及mRNA 的提取
        2. 双链cDNA 的合成及RsaⅠ酶切
        3. 双链cDNA 与接头的连接效率检测
        4. 消减 PCR 产物检测
        5. 消减效率的检测
        6. 大鼠心肌缺血-再灌注诱导表达上调基因的消减cDNA 文库的构建
        7. 反向 Northern 点杂交初步筛选差异表达基因
        8. 测序和序列分析
        9. RT-PCR 和 Northern blot 进一步验证差异表达
    三、 讨论
第二章 采用cDNA 微阵列结合聚类分析探讨大鼠心肌短暂缺血-再灌注后不同时间点基因表达谱的改变
    一、 材料和方法
        1. 材料
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暂缺血-再灌注动物模型的制备
            2.2 cDNA 芯片检测与分析
            2.3 聚类分析
    二、 结果
        1 cDNA 芯片结果
        2. 聚类分析
    三、 讨论
第三章 大鼠心肌短暂缺血-再灌注诱导表达上调的新基因 Mip1 的克隆和特性分析
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 载体和菌株
            1.2 试剂
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 EST 拼接
            2.2 电子克隆
            2.3 RACE 技术获取基因5′末端
                2.3.1 cDNA 第一链的合成
                2.3.2 5′RACE 扩增
                2.3.3 测序和拼接
            2.4 RT-PCR 验证所获基因全长
            2.5 多组织膜 Northern 杂交
            2.6 生物信息学分析 Mip1 的核酸和蛋白质特性
    二、 结果
        1. EST 拼接与电子克隆
        2. 5′RACE 扩增
        3. RT-PCR 验证所获基因全长
        4. 多组织膜 Northern 杂交结果
        5. Mip1 的核酸与蛋白质特性的生物信息学分析
    三、 讨论
第四章 新基因 Mip1 功能的初步研究
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 实验动物
            1.2 细胞
            1.3 载体和菌株
            1.4 试剂
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暂缺血-再灌注动物模型的制备
            2.2 Northern blot 检测Mip1 在大鼠心肌短暂缺血-再灌注后不同时间点的表达
            2.3 Mip1 的真核表达质粒Mip1-pEGFP-N1 和Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)的构建
                2.3.1 加端 PCR 扩增 Mip1 的 ORF
                2.3.2 PCR 产物及载体的酶切及回收
                2.3.3 连接与转化
                2.3.4 质粒 DNA 的小量制备
                2.3.5 Mip1-pEGFP-N1 和 Mip1-pcDNA3.1 重组子的鉴定
                2.3.6 质粒 DNA 的大量制备
            2.4 Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激时的亚细胞定位
            2.5 稳定表达 Mip1 的 C2C12细胞株的建立
                2.5.1 转染和 G418 筛选
                2.5.2 Western blot 筛选高表达克隆
            2.6 H_2O_2浓度的测定
            2.7 H_2O_2损伤实验
            2.8 LDH 释放率检测
            2.9 Hoechst 33258 染色检测细胞凋亡发生率
            2.10 流式细胞术检测Mip1对细胞周期的影响
            2.11 统计处理
    二、 结果
        1. Northern blot 检测Mip1 在大鼠心肌短暂缺血-再灌注后不同时间点的表达
        2. Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激时的亚细胞定位
            2.1 Mip1-pEGFP-N1 重组质粒的鉴定
            2.2 Mip1 蛋白在正常和氧化应激时的亚细胞定位
        3. 稳定表达 Mip1 的 C_2C_(12)细胞株的建立
            3.1 Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)重组质粒的鉴定
            3.2 Western blot 筛选高表达 Mip1 的细胞克隆
        4. LDH 释放率的测定
        5. Hoechst 33258 染色检测细胞凋亡发生率
        6. 流式细胞术分析Mip1对细胞周期的影响
    三、讨论
结论
参考文献
综述1
综述 2
攻读学位期间主要的研究成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的筛选和鉴定[J]. 袁灿,吕青兰,陈广文,刘瑛,王尧玲,刘海军,邹江,肖献忠.  生物化学与生物物理进展. 2003(03)
[2]用cDNA芯片检测大鼠心肌缺血预适应后基因表达谱的改变[J]. 吕青兰,袁灿,张华莉,陈广文,王尧玲,邓恭华,涂自智,肖献忠.  中国动脉硬化杂志. 2003(03)



本文编号：3654273