脂筏在fMLP诱导的人中性粒细胞极性化过程中作用的研究

发布时间：2017-05-14 15:03

  本文关键词：脂筏在fMLP诱导的人中性粒细胞极性化过程中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 中性粒细胞(Polymorphonuclear nertrophils)是机体免疫系统的重要组成部分。中性粒细胞在宿主抵抗细菌和真菌感染中起着重要的作用,他们的主要功能是在机体发生炎症时,通过外渗出血管壁并迁移到炎症位置,通过吞噬作用和释放超氧化物和/或蛋白水解酶杀死细菌和入侵的微生物。一旦感知到趋化物质的存在,中性粒细胞前极形成一个富含丝状肌动蛋白的片状伪足,后极形成富含肌球蛋白的尾足。虽然中性粒细胞在生理功能中发挥重要作用,但如果迁移和外渗的机制和任何信号分子调控失败,都会导致中性粒细胞的异常激活。临床上一些疾病如类风湿性关节炎、哮喘、败血症、缺血/再灌注损伤、病毒性心肌炎、动脉粥样硬化、过敏反应、炎症性皮肤病甚至肿瘤的发生和转移都和中性粒细胞极性功能有关。因而研究中性粒细胞极性机制,对防止中性粒细胞异常激活导致的各种疾病和组织损伤具有重要意义。 在极性研究的过程中,脂筏作为信号分子组织者是近些年的研究热点。脂筏就像一个蛋白质分子停靠的平台,在受到外源趋化物的诱导下,它组装大量的信号分子,与膜的信号转导、蛋白质分选等保持高度密切的关系。脂筏上的胆固醇能够被甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin, mpCD)包裹,从而破坏脂筏的结构。在研究中使用mβCD包裹胆固醇后破坏脂筏结构完整性,抑制了细胞的皱褶形成,使用CLM可以可逆性修复脂筏结构的完整性,这表明脂筏在中性粒细胞极性化过程中有着很重要的作用。 近年来,细胞内游离钙浓度(cytosolic free Ca2+concentration, Ca2+)变化被认为参与中性粒细胞多种功能调节,如极性(趋化)和迁移、活性氧的产生。胞质内Ca2+浓度升高依赖于两种途径：内质网钙库释放和细胞膜外钙内流。胞外钙内流主要由内质网钙库清空引起质膜上的钙通道开放导致外钙内流,就是所谓的钙库操纵的钙内流机制(store-operated Ca2+entry,SOCE).脂筏作为SOCE的信号平台对于中性粒细胞极性化有着重要的作用,因而探讨中性粒细胞极性化过程中膜电流的特性就显得尤其重要,可以为研究中性粒细胞极性化提供电生理理论依据。 另有研究表明Rho小G蛋白参与极性形成、细胞的迁移、肿瘤的侵袭与转移等。尤其是Racl,Rac2通过调节细胞骨架而参与细胞极性和趋化的调节机制已经有很多文献报道过。Rho家族小G蛋白在中性粒细胞中参与细胞骨架重组,这些蛋白通过失活(GDP-bound)和激活(GTP-bound)两种状态的循环来控制一些生理过程,他们的活性是由鸟嘌呤核苷分解抑制因子(guanosine dissociation inhibitors), GTPase活化蛋白(GTPase activating proteins)和鸟嘌呤核苷交换因子(guanosine exchange factors,GEF)来调节。 因此,深入阐明脂筏在fMLP所诱导的人中性粒细胞极性化的影响过程中的作用,为防止和治疗中性粒细胞异常激活提供新的方向。 目的 本实验通过研究脂筏对fMLP所诱导的人中性粒细胞极性的影响,探讨脂筏在人中性粒细胞极性中的调控机制。 方法 1.采用Dextran方法让红细胞自然沉降,运用经典密度梯度离心,低渗裂解红细胞后急性分离人外周血中性粒细胞。获得的中性粒细胞进行台盼蓝染色,分析细胞活性,细胞的活度大于98%。 2.用Zigmond chamber观察中性粒细胞的极性化率。 3. Transwell小室实验检测中性粒细胞的定向迁移能力的变化。 4.运用膜片钳相关仪器检测电极电阻并对中性粒细胞进行封接和破膜,记录膜电容和各种处理因素膜电流的变化。 5.使用钙离子敏感性指示剂Fluo-4/AM预处理细胞后,在激光共聚焦显微镜下监测细胞内钙离子的变化情况。 6.应用GST-pull down and Western blotting方法检测活性Rac1, Rac2蛋白的表达。 7.实验数据用均数±标准差(x±SD)表示,数据经SPSS13.0软件处理分析。三组及三组以上样本均数比较满足方差齐性用One-way ANOVA方差分析,组间两两比较采用LSD法；若方差不齐,采用welch检验,组间两两比较采用Dunnett's T3法。P0.05为存在显著性差异。 结果 1. fMLP可诱导中性粒细胞产生SOCE,并使膜电位增加。 2. mpCD和CLM均能引起中性粒细胞膜电流的变化,与对照组或／和fMLP组比较,电流密度变化均有统计学意义(P0.05)。mpCD破坏脂筏结够完整性后抑制了fMLP诱导的细胞外钙内流,CLM可逆性恢复脂筏结构后细胞外钙内流增加。 3. Zigmond chamber实验显示mpCD破坏细胞脂筏结构完整性后极性化率下降,CLM可逆性恢复脂筏结构完整性后极性化率上升。 4. Transwell小室检测中性粒细胞的迁移能力的变化实验中,mβCD破坏细胞脂筏结构完整性后定向迁移能力显著性下降,CLM恢复细胞脂筏结构完整性后中性粒细胞定向迁移能力与mpCD组相比显著性增加。 5.免疫印迹结果显示fMLP刺激组显示活化的Rac2、Rac1的蛋白条带最浓,当脂筏结构完整性用mpCD破坏后再进行fMLP刺激,则细胞内活化的Rac2、Rac1的蛋白条带都比fMLP刺激组弱。而用CLM恢复细胞脂筏结构后则细胞内活化的Rac2、Rac1的蛋白条带比mβCD组强但比fMLP刺激组弱。 结论 1. fMLP可诱导中性粒细胞膜电流发生改变,这种改变可能参与介导SOCE的变化。 2.破坏脂筏结构完整性的药物(mpCD)能降低fMLP诱导极性细胞的膜电流,可逆性恢复脂筏结构完整性药物(CLM)可部分恢复fMLP诱导极性细胞的膜电流。 3. mβCD通过打破脂筏结构完整性进而抑制SOCE, CLM则可以部分恢复SOCE。 4.mβCD可降低fMLP诱导的中性粒细胞极性化率和定向迁移力,CLM能部分恢复fMLP诱导细胞的极性化率和定向迁移力。 5.脂筏结构完整性可上调极性信号分子Rac1和Rac2蛋白的活性水平,从而实现对中性粒细胞极性的调控。
【关键词】：脂筏 中性粒细胞 极性 SOCE 膜电位 定向迁移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 材料和方法18-34
• 1. 材料18-24
• 2. 实验方法24-33
• 3. 数据处理33-34
• 结果34-52
• 1. fMLP诱导人中性粒细胞的膜电流与SOCE34-37
• 2. 打破脂筏结构完整性与可逆性修复对膜电流和SOCE的影响37-46
• 3. Zigmond chamber观察不同处理因素下fMLP诱导的人中性粒细胞极性化率的变化46-48
• 4. 脂筏在fMLP诱导的中性粒细胞定向迁移的影响48-50
• 5. 中性粒细胞内活化的Rac2、Rac1蛋白的影响50-52
• 讨论52-60
• 全文小结60-61
• 参考文献61-69
• 英文缩略词表69-71
• 硕士期间发表论文71-72
• 致谢72-73

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