人FL的甲醇酵母表达及腺病毒介导的免疫基因治疗

发布时间：2022-07-12 17:26

　　人FL（flt3 ligand）是近年发现的重要造血细胞因子，其功能类似于hSCF，主要作用于早期原始的干／祖细胞，促进其增殖和分化，与其它细胞因子联合应用，可产生明显的协同作用。与hSCF不同的是，hFL对肥大细胞没有作用，没有种属特异性，并且可显著刺激树突状细胞（DC）和自然杀伤细胞（NK）的增殖。这些功能使FL在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、造血干细胞移植，特别是在肿瘤免疫基因治疗和免疫疫苗制备等方面具有重要的潜在应用价值。DCs细胞作为功能最强的抗原提呈细胞（APC），在免疫应答反应中起着关键作用，能诱导非特异性先天免疫反应和特异性获得免疫反应。利用FL扩增DCs的抗肿瘤免疫治疗效果，在动物模型中已得到验证。本研究利用hFL能显著刺激体内DCs增殖的生物学特性，用基因工程方法表达重组hFL，对小鼠种植瘤进行抑瘤效果试验，为进一步研究hFL在肿瘤免疫治疗中的有效作用提供实验依据。本论文主要包括两部分内容： 一、应用酵母表达系统，表达分泌性人FL（hFL）的K84E／Q122R突变体。hFL第84位和122位氨基酸的密码子分别改造为E和R的密码子，并在N端采用甲醇酵母... 

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

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图表目录
中文摘要
Abstract
英文略语表
前言
第一部分 人FL在甲醇酵母中表达、纯化、体外活性测定及小鼠抗肿瘤实验
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 菌株
        1.3 质粒
        1.4 工具酶
        1.5 主要化学试剂
        1.6 细胞培养试剂和消耗材料
        1.7 其它材料
        1.8 主要仪器及设备
        1.9 培养基的配制
        1.10 主要溶液配方
        1.11 引物
    2 实验方法
        2.1 表达质粒的构建
        2.2 重组蛋白在Pichia pastoris中的表达及纯化
        2.3 重组蛋白理化性质测定
        2.4 重组蛋白体外活性测定
        2.5 鼠皮下移植EL4淋巴瘤模型的治疗实验
    3 实验结果
        3.1 人FL基因的获得
        3.2 重组表达质粒pPIC9K-hFL的构建
        3.3 重组蛋白在Pichia pastoris中的表达及纯化
        3.4 hFL理化性质测定
        3.5 hFL体外活性测定
        3.6 重组蛋白体内抗肿瘤实验
    4 讨论
        4.1 甲醇酵母高表达转化子的筛选方法
        4.2 hFL表达条件优选
        4.3 hFL的糖基化
        4.4 hFL活性检测
第二部分 腺病毒介导人FL和人GM-CSF联合基因治疗恶性肿瘤
    5 实验材料
        5.1 细胞系
        5.2 菌株
        5.3 质粒
        5.4 其它材料
        5.5 引物
    6 实验方法
        6.1 重组腺病毒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP的构建
        6.2 体内外表达量测定
        6.3 体外活性测定
        6.4 重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF联合基因扩增脾脏树突状细胞
        6.5 重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF联合基因治疗恶性肿瘤
    7 实验结果
        7.1 高滴度重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP的制备
        7.2 体内外表达量测定
        7.3 体外活性测定
        7.4 重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF联合基因扩增脾脏树突状细胞
        7.5 重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF联合基因治疗恶性肿瘤
        7.6 肿瘤组织病理切片
    8 讨论
        8.1 穿梭质粒的改造与构建
        8.2 细菌内同源重组
        8.3 重组腺病毒的包装
        8.4 重组腺病毒表达hFL和hGM-CSF及体内外活性实验
小结
论文参考文献
综述一：FL在骨髓的造血和免疫功能调控中的作用
综述二：靶向腺病毒载体
综述三：造血干细胞基因治疗研究进展
综述四：真核DNA复制机制的研究进展
博士期间发表论文、综述及专利情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]瘤内注射携带Flt3配体的重组腺病毒治疗小鼠肝癌[J]. 杨庆,杨广顺,卫立辛,杨宁,贾凤歧,吴孟超.  中华实验外科杂志. 2002(04)
[2]腺病毒介导的小鼠Flt3配体抗肝癌基因治疗的研究[J]. 杨庆,杨广顺,卫立辛,贾凤岐,吴孟超,郭亚军.  中华医学杂志. 2002(11)
[3]人FL在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化和生物学活性测定[J]. 张友鸿,周希亚,陈松森,娄可佳,刘深基,杨克恭,何维.  基础医学与临床. 2002(02)
[4]人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达[J]. 王冠军,马俐君,李梁,裴雪涛.  中国免疫学杂志. 2001(06)
[5]人白细胞介素-17基因的克隆、表达及其表达产物的分离纯化[J]. 王建勋,陈松森,狄旭,宋卫华.  中国生物化学与分子生物学报. 1999(03)
[6]腺病毒载体效能改进[J]. 徐敏毅.  中国肿瘤生物治疗杂志. 1999(01)
[7]人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达[J]. 陈卫东,狄旭,李江,宋飞,陈松森,梁植权.  中国医学科学院学报. 1997(01)
[8]人胎肝FLT3配基膜外区基因的克隆及其在COS-7细胞中的表达[J]. 周生,毛宁,刘元林,杜德林,唐佩弦,潘凌亚.  实验血液学杂志. 1996(03)



本文编号：3659544