FGF-1-mscFv的人源化改造和可溶性表达

发布时间：2017-05-15 22:10

  本文关键词：FGF-1-mscFv的人源化改造和可溶性表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：单链抗体(single chain variable fragment，scFv)是一种小分子基因工程抗体，具有异源性低，分子量小，穿透力强，且易于生产等优点。因此，本实验室从一株FGF-1特异性的杂交瘤中克隆了抗FGF-1抗体的轻链可变区基因(VL)和重链可变区(VH)基因，并通过Linker将其连接成单链抗体FGF-1-mscFv。但是现有研究表明鼠源单链抗体在临床应用中会在人体中产生人抗鼠抗体（humananti-mouse antibody，HAMA）反应，这不仅会降低抗体药物的疗效，同时强烈的致敏反应还产生一定的副作用，因此我们将鼠源的FGF-1-mscFv氨基酸序列进行了人源化的改造。首先对mscFv的氨基酸序列在人源抗体数据库中进行比对，寻找到同源性最高的氨基酸序列作为人源化的框架区(framework region,FR)模板，然后对mscFv可变区按照kabat原则进行互补决定区(complementary-determining region,CDR)序列分析，确定了重链和轻链各三组的CDR的氨基酸序列。通过固定位置分析法分析了FR中可能对CDR空间结构有影响的游标残基、特异性残基、重链轻链交界面残基、正则残基。利用同源建模原理对mscFv进行了三维空间结构建模并分析了空间结构中的包埋残基、抗原结合活性位点残基和CDR邻近残基，这些残基在维持亲本抗体抗原结合活力中可能发挥作用，，应该在人源化序列中保留。接下来又分析了mscFv空间结构中的表面残基，为了降低人源化抗体的HAMA反应，这些残基应该尽量在人源化序列中被替换。结合mscFv的CDR序列、人源FR模板以及FR模板中需要回变的氨基酸残基，最终获得了人源化的hscFv的氨基酸序列以及密码子优化的核苷酸序列，我们将728bp的mscFv和hscFv核苷酸序列重组到了可溶性表达载体pET22b上分别获得了重组质粒pET22b-mscFv和重组质粒pET22b-hscFv。利用优化的菌株，载体，温度，培养基，诱导剂浓度等条件，分别获得了周质腔可溶蛋白mscFv以及hscFv，其中hscFv分子量在30kd左右，并且通过免疫印迹法实验证明hscFv含有pET22b载体上的His标签，酶联免疫吸附ELISA法检测证明人源化改造的hscFv仍能和FGF-1结合。为我们进一步研究hscFv在真核细胞水平上的功能打下了基础。
【关键词】：单链抗体 抗体人源化 CDR移植抗体 可溶性蛋白
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 引言8-14
• 1.1 单克隆抗体在应用上存在的问题及解决办法8-11
• 1.1.1 重组抗体片段8
• 1.1.2 人源化抗体8-11
• 1.2 真核蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达11-13
• 1.3 立题依据13-14
• 2 材料和方法14-21
• 2.1 实验材料14
• 2.1.1 质粒和菌株14
• 2.1.2 主要试剂14
• 2.2 实验方法14-21
• 2.2.1 抗 FGF-1-mscFv 的重链和轻链可变区的人源化设计14-16
• 2.2.2 pET22b-mscFv 表达载体的构建16-17
• 2.2.3 Rosetta 感受态的制备17
• 2.2.4 鉴定 pET22b-mscFv 基因在大肠杆菌中的诱导表达17-18
• 2.2.5 pET22b-mscFv 基因在大肠杆菌中周质腔的表达情况检测18
• 2.2.6 pET22b-hscFv 基因在大肠杆菌中的诱导表达条件优化18
• 2.2.7 免疫印迹法检测 pET22b-hscFv 在大肠杆菌周质腔中的诱导表达蛋白18-19
• 2.2.8 ELISA 检测 hscFv 与 FGF-1 结合活性19-21
• 3 实验结果21-35
• 3.1 人源化设计和氨基酸译本的确定21-29
• 3.1.1 人源 FR 模板的选择21-23
• 3.1.2 各个 CDR 区的确定23-24
• 3.1.3 固定位置法分析框架区需要保留的鼠源残基24-25
• 3.1.4 对 mscFv 三维结构同源建模并分析重要的氨基酸残基25-26
• 3.1.5 氨基酸模板的确定以及密码子的优化26-29
• 3.1.6 人源化改造后的 VH 和 VL 的人源程度评价29
• 3.2 pET22b-mscFv 原核表达载体的构建29-30
• 3.3 pET22b-mscFv 基因在大肠杆菌中的诱导表达30-31
• 3.4 pET22b-hscFv 基因在大肠杆菌中的诱导表达31-33
• 3.5 免疫印迹法检测周质腔表达蛋白与 His 单抗结合的专一性33-34
• 3.6 ELISA 检测周质腔可溶蛋白 hscFv 与 FGF-1 结合活力34-35
• 4 讨论35-38
• 5 结论38-39
• 参考文献39-42
• 致谢42

【引证文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 刘丰;人抗乙肝表面抗体在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2014年

  本文关键词：FGF-1-mscFv的人源化改造和可溶性表达，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：369018