通过RNA-seq初步考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的全局性调控作用

发布时间：2017-05-15 22:15

  本文关键词：通过RNA-seq初步考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的全局性调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，属于假单胞菌科，普遍存在于水和土壤中，为典型的人类条件致病菌，其感染可发生于呼吸道，尿道，烧伤和创伤等[1]。由于对多种抗生素都具有抵抗力，铜绿假单胞菌成为重要的医院内病原菌[2]。铜绿假单胞菌不仅含有自己的药物抗性基因，还能从其他细菌获取抗性基因[3]。多年来，已有大量研究致力于阐明铜绿假单胞菌的致病性和耐药性，自基因组测序技术开始，这些研究逐步从传统的以单一细菌毒力决定簇为核心的致病性研究转向大规模的全基因组分析。 标准株PAO1是第一株被测序的铜绿假单胞菌，最显著的特征是其基因组为细菌中最大的基因组之一，包含了6260，000个碱基对和90%的蛋白编码基因，此外还含有与酵母菌细胞相当的5570个开放阅读框。这种基因组的复杂性正是铜绿假单胞菌在各种复杂环境下生存繁殖并对耐受多种抗生素的原因所在[4]。PA3是由本科室从烧伤科分离得到的一株铜绿假单胞菌，其基因组的特征与PAO1相似。RNA-seq技术使我们能够动态地观测铜绿假单胞菌的基因组对各种刺激的反应。从而我们能可以进一步分析研究多个野生株和铜绿假单胞菌的临床分离株的基因组特征及存在于不同的菌株之间的核心基因成分，并且还能弄清那些在特殊环境下对细菌的生存具有促进作用的基因，而这些基因的表达都是由转录调控子介导的转录所控制的。并且PAO1有10%的基因组属于转录调控子，这再一次提示铜绿假单胞菌的基因表达是在转录调控子的紧密调控下完成的。 噬菌体作为一种寄生生物，与宿主菌共存，能利用宿主菌的大分子合成装置进行复制，这一过程涉及了众多调控机制[5]。噬菌体需要在转录水平上控制宿主菌的多个转录调控子，使有利于噬菌体复制的基因表达，其他无关的基因则被抑制[6]。本课题通过基于Illumina高通量测序平台的RNA-seq技术对来源于铜绿假单胞菌噬菌体PaP3感染宿主菌PA3后五个时间点的总转录本进行了序列测定，通过生物信息学分析鉴定出差异表达基因并对其进行了GO功能及KEGG Pathway显著富集性分析，同时对新转录本，非翻译区(Untranslated Regions，UTRs)，启动子和非编码小RNA(sRNA)进行了检测及初步分析，全面快速地获取了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对其宿主菌PA3转录组全局性调控的基本信息。本研究的主要内容及结果包括以下几个方面： 1.铜绿假单胞菌PA3被噬菌体PaP3感染后的转录组测序评估：测序所得的Reads能够比对到参考基因组和参考基因序列的平均比例分别为94.09%和61.25%；通过减法杂交的rRNA平均去除率高达99.6%，去除杂质后的clean reads比对到参考基因组和参考基因上的比例符合覆盖整个基因组和转录组的要求。基因覆盖度在70%-100%的Reads平均为4298条，占所有测序基因的80%。RNA打断的随机性好，Reads在基因的各个部位分布比较均匀，所测数据符合后续基因表达注释的标准。 2.铜绿假单胞菌PA3被噬菌体PaP3感染后的基因动态表达分析：根据RPKM表达量算法共得到5536个差异表达基因，其中5466个为PA3的基因，70个为PaP3的基因。PA3的差异表达基因归属于27条PseudoCAP功能注释，KEGG Pathway显著性富集分析涉及了31条代谢路径。分析发现，被PaP3感染后PA3中87.5%的σ因子、81.5%的必需基因和86.5%的核心基因出现差异表达。PA3的差异基因中有4174个基因下调表达，这些下调基因绝大多数受细菌全局性调控系统调节。利用VFBD数据库比对显示，76.5%已注释毒力相关基因下调表达。可见，噬菌体PaP3可能通过抑制宿主菌PA3转录调节相关基因而对宿主的转录组进行全局性的调控。 3.铜绿假单胞菌PA3的转录组结构及5'非翻译区(5'UTRs)分析：我们分别对PA3被噬菌体感染后不同时间点的六个样本的转录本(TUs)进行了TSS检测，所检测的TUs、SD序列以及Rho-independent终止子数目在各样本中基本一致，每个样本平均检测到3570个TUs、1834个SD序列和322个终止子。确定了TUs的5’端以及其下游基因的5’UTR，统计发现50%5’UTR以上的长度都集中在200nt以下的范围。PA3被PaP3感染的不同时期，所测的5’UTR总量基本没有变化。而在长度分布上，200nt以下的5’UTRs变化显著。我们推测，在PA3中发挥调控作用的主要是长度在200nt以下的5’UTRs，PaP3可能会作用于这些小于200nt的5’UTR而调控宿主的基因转录。 4.铜绿假单胞菌PA3被噬菌体PaP3感染后的sRNA表达的研究：铜绿假单胞菌中已注释的19种sRNA在本研究中均出现了差异表达。有9种在五个时间点中均下调表达，仅P18和P34在整个过程表达上调。除上述已注释的sRNA基因外，我们还检测出1329个新的候选sRNA，统计出其中有意义的差异表达的候选sRNA91种：50种上调，41种下调。提示这些sRNA可能与噬菌体的感染及细菌的抵抗有关，但需进一步的实验验证及深入的功能分析。 综上所述，利用直接的高通量cDNAs测序方法(RNA-seq)分析发现，铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的调控涉及基因的各个结构、功能和途径，范围广，，影响深，有直接调控，也有间接调控。这种全局性综合性的调控方式，使得噬菌体PaP3能在抵抗宿主菌免疫反抗的同时快速有效地利用宿主的装置进行自我复制。本研究所提供的是一种动态的转录组表达信息，为进一步深入研究噬菌体-宿主相互作用奠定了良好的基础。
【关键词】：铜绿假单胞菌噬菌体 转录组学 UTRs sRNA
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.991
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 铜绿假单胞菌 PA3 被噬菌体 PaP3 感染后的转录组测序评估14-27
• 2.1 试剂与材料15-17
• 2.2 实验方法17-20
• 2.3 结果与讨论20-27
• 第三章 铜绿假单胞菌 PA3 被噬菌体 PaP3 感染后的基因动态表达分析27-65
• 3.1 分析方法27-30
• 3.2 结果与讨论30-65
• 第四章 铜绿假单胞菌 PA3 的转录组结构及 5'非翻译区(5'UTRs)分析65-70
• 4.1 分析方法66-67
• 4.2 结果与讨论67-70
• 第五章 铜绿假单胞菌 PA3 被噬菌体 PaP3 感染后的 sRNA 表达的研究70-75
• 5.1 分析方法71-72
• 5.2 结果与讨论72-75
• 全文总结75-76
• 参考文献76-82
• 文献综述 噬病毒体的研究进展82-90
• 参考文献88-90
• 攻读硕士学位期间发表的文章90-91
• 致谢91

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本文编号：369040