膜蛋白Flotillin-1与细胞膜朊蛋白PrP~C内吞相关性研究

发布时间：2017-05-16 11:11

  本文关键词：膜蛋白Flotillin-1与细胞膜朊蛋白PrP~C内吞相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：朊病毒病,又称可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一类能够感染人和动物神经系统的致死性神经退行性疾病,也称为朊病毒病(prion diseases)。包括人类的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、Kuru病、家族性致死性失眠症(fatal familial insomnia, FFI)以及GSS综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS),在动物中常见的有牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)、羊瘙痒病(Scrapie)以及鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。目前普遍认为其致病原为具有蛋白酶抗性以及高度感染性的异常朊蛋白(PrPSc),它是由生物体内细胞PRNP基因编码产生的正常朊蛋白PrPC发生了不可逆构象转化后形成,但具体形成机制仍不清楚。 尽管PrPSc是朊病毒病主要致病因子的观点已被人们广泛接受,但对其正常异构体蛋白PrPC的生物学功能了解甚少。正常朊蛋白PrPC是一种广泛表达于细胞膜上的磷脂酰肌醇(GPI)锚定糖蛋白,有报道称,PrPc可能是某些神经细胞的营养因子,与神经细胞的生长分化有关；PrPC参与了细胞间黏附、识别以及信号转导；并且与细胞抗凋亡过程以及细胞内金属离子的转运和代谢等生理活动密切相关。而PrPC的内吞转运机制在PrPC实现诸如细胞信号转导,金属离子转运等生理功能以及PrPc向PrPsc的转化形成过程中都具有非常重要的作用,是其实现这些生理功能的基础。但目前对PrPc内吞机制的研究并不清楚,对其内吞途径的研究也一直存有争论,主要的观点认为PrPC的内吞可能是由网格蛋白(Clathrin),小窝蛋白(Caveolin)或Arf6蛋白所介导,但都没有明确的定论,因此,对PrPc内吞机制的研究势必将有利于我们更好的认识PrPC正常生理功能以及对Prpsc形成机制的研究提供助力。 膜相关蛋白Flotillins,包括Flotillin-1(Flot-1)和Flotillin-2(Flot-2),二者在哺乳动物细胞中广泛表达,有较高同源性,且均为SPFH超家族成员,这一类蛋白N端具有重复的谷氨酸和丙氨酸重复序列,称为SPFH(Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflK/C)结构,但家族成员蛋白的功能并不是很清楚。目前的研究发现Flot-1/-2蛋白主要分布在细胞膜的脂质微区,能够募集膜上的蛋白因子,为这些蛋白因子参与细胞各类生理活动提供反应平台,被称作是细胞膜上的“脚手架”蛋白。有报道证实,膜相关蛋白Flotillin-1是一种新的内吞转运蛋白,它在细胞中介导了一类完全不同于网经格蛋白(Clathrin)所介导的内吞途径,并且研究表明该蛋白倾向于介导细胞膜上一类GPI锚定蛋白(如CD59、 Thy-1、GM1等)内吞进入细胞,并且与细胞的内吞生理活动密切相关。而该蛋白是否也参与了同样是GPI锚定蛋自的PrPC的内吞,目前还未有报道。 因此,本研究利用铜离子刺激细胞,建立PrPC内吞的稳定细胞模型,研究在这一过程中Flot-1蛋白与细胞PrPC内吞的相关性。以期揭示Flot-1在PrPc内吞机制中可能的作用,为更好的研究PrPC内吞机制及其在生理活动中所起的作用提供一些帮助。 本研究的主要结果如下： 1.在建立稳定的铜离子刺激细胞PrPc内吞的细胞模型过程中,证实在铜离子剌激PrpC内吞过程中,细胞内PrPc与Flot-1存在相互作用；并且这种相互作用现象的发生与铜离子浓度和铜离子刺激细胞的时间紧密相关。 2.证明了在已报道的能与PrPc结合的二价阳离子中,除二价铜离子外,二价锌离子刺激细胞也能促使细胞内Flot-1与PrPc发生相互作用,而其它二价阳离子处理细胞后并没有检测到两蛋白之间相互作用的发生。 3.利用细胞免疫荧光实验观察到在铜离子刺激细胞PrPc内吞过程中,Flot-1与PrPc在细胞内有明显的共定位以及共聚集现象。 4.利用RNAi技术干扰细胞内源Flot-1蛋白的表达,发现随着Flot-1表达量的下降,PrPC在铜离子刺激下的内吞活动受到了明显的抑制。 5.利用铜离子刺激本身没有PrPc内源表达的细胞系—人胚肾细胞HEK293,细胞免疫荧光实验没有观察到Flot-1进入细胞内的现象,表明Flot-1蛋白可能是通过与PrpC蛋白相互作用的方式参与并介导铜离子刺激细胞PrPc内吞的过程, 6.利用PrP八肽重复区缺失突变体(PrP-PGO)以及野生型PrP(PrP-PG5)分别转染HEK293细胞,并用细胞免疫荧光实验观察铜离子刺激细胞PrP内吞过程中,发现PrP八肽重复区缺失后,PrP-PGO并不会发生内吞现象,且Flot-1与PrP-PGO在细胞内也没有共定位现象。而转染的野生型PrP(PrP-PG5)依然会发生内吞,且在内吞过程中与F1ot-1依然存在明显的共定位现象。 综上所述,我们通过免疫印迹,免疫共沉淀,细胞免疫荧光,RNAi等一系列实验方法证明了在铜离子刺激细胞PrPc内吞过程中,Flot-1参与并介导了细胞膜PrPc的内吞,进一步的实验证明铜离子刺激Prpc内吞与PrPc八肽重复区紧密相关,因而我们认为PrPc八肽重复区结合铜离子后改变了PrPc本身的构象,使得其与Flot-1更易发生相互作用,从而介导了PrPc内吞进入细胞。
【关键词】：朊病毒病 朊蛋白 flotillins 铜离子 内吞
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-18
• 实验材料18-23
• 1.主要化学试剂18-19
• 2.分子量标准及试剂盒19
• 3.合成的三条Flot-lRNA干扰序列（GenePharma公司，，上海）19-20
• 4.质粒载体20
• 5.细胞株20
• 6.培养基20
• 7.主要仪器及设备20-21
• 8.常用缓冲液及溶液21-23
• 实验方法23-29
• 1.细胞培养和瞬时转染23-24
• 2.不同二价金属阳离子处理细胞24
• 3.细胞裂解产物的制备及蛋白浓度的测定24-25
• 4.免疫共沉淀实验及Western Blot检测25-26
• 5.细胞免疫焚光染色26-27
• 6.细胞膜蛋白及胞i}蛋白的分步提取27-28
• 7.统计学处理28-29
• 实验结果29-45
• 讨论45-49
• 小结49-50
• 参考文献50-57
• 综述57-64
• 参考文献61-64
• 缩略词对照表64-66
• 个人简历66-69
• 致谢69-70
• 附录70

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Li-Li QING;Hui ZHAO;Lin-Lin LIU;;Progress on low susceptibility mechanisms of transmissible spongiform encephalopathies[J];动物学研究;2014年05期

2 霍佳;钱俊乔;李陈莉;j口京一;郭浅妤;钱金泽;;探讨小鼠肌肉组织中老化淀粉样变纤维的传播性[J];中国人兽共患病学报;2014年12期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 刁小龙;鸡朊蛋白参与DF-1细胞增殖粘附的功能研究[D];甘肃农业大学;2013年

2 章志宏;重组朊病毒的体外制备及动物模型研究[D];华东师范大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 朱淼;铜离子对朊蛋白转基因线虫的影响[D];黑龙江八一农垦大学;2013年

2 李雅楠;芦丁和Anti-XD5分别对IAPP和β-淀粉样蛋白影响的研究[D];宁夏大学;2013年

3 白换力;姜黄素和阿魏酸抑制朊病毒复制作用的研究[D];吉林大学;2014年

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本文编号：370674