三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白原核表达及免疫原性差异性研究

发布时间：2017-05-18 21:16

  本文关键词：三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白原核表达及免疫原性差异性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：嗜吞噬细胞无形体（Anaplasmaphagocytophilum）属于立克次体目无形体科无形体属，是一类直径为0.2-1.0um的经蜱传播的严格细胞内寄生的革兰氏阴性菌，主要引起人粒细胞无形体病（HumanGranulocyticAnaplasmosis，HGA）。自20世纪90年代初于美国首次发现以来，澳洲、欧洲多国、韩国及我国先后均有报道，且近年来呈上升趋势。2006年安徽芜湖弋矶山医院的人粒细胞无形体病院内传播感染事件是我国第一次报道的人粒细胞无形体病感染确诊病例，也是世界范围内首次报导的人粒细胞无形体人传人事件。由于该病的临床多表现为急性不明原因发热，肌肉痛，乏力，头痛等类似病毒感染性疾病症状，临床缺乏对该病的足够认识，也缺乏相应的快速诊断方法，因此该病及易发生误诊，严重时可导致多器官功能衰竭，甚至死亡。 为探索人源无形体不同分离株AnkA蛋白免疫原性是否存在差异，进一步揭示这些蛋白质间可能存在结构及免疫表位差异以及可能相关的与宿主细胞作用蛋白谱差异。首先利用DNAMAN软件比对美国Webster株、斯洛文尼亚1567株和美国96HE58株人源无形体分离株AnkA蛋白氨基酸序列，结果发现三株菌AnkA蛋白的一致性为90.2%，Webster株与96HE58株AnkA蛋白的一致性最高，为95.2%，1567株和96HE58株AnkA蛋白的一致性最低，为90.6%。对这三株无形体AnkA蛋白B淋巴细胞线性表位预测分析发现Webster株和96HE58株人分离株无形体AnkA蛋白抗原表位存在一个差异，而它们与1567株AnkA蛋白抗原表位预测结果差异较大。 我们对3株无形体不同ankA基因进行了原核表达，同时进行了免疫原性初步分析。利用PCR技术扩增了嗜吞噬细胞无形体Webster株，斯洛文尼亚1567株，美国96HE58株ankA基因部分序列，构建pET-30a-AnkA表达载体，转化至大肠杆菌BL21中，以IPTG诱导高效表达融合蛋白，经飞行质谱鉴定氨基酸序列，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。采用ELISA和Westernblot方法分析三株菌AnkA重组蛋白与免疫小鼠血清抗体相互间，以及与10种常见的立克次体目成员阳性抗体鼠血清间的免疫反应。同时检测三株菌AnkA重组蛋白与我国无形体病人血清抗体反应性。结果表明表达的重组蛋白主要以可溶性形式存在，小鼠免疫获得高效价抗AnkAIgG抗体，三株菌重组蛋白免疫抗体之间存在免疫交叉性，与立克次体目成员间存在免疫交叉性。三株菌重组蛋白与我国无形体病人血清抗体存在免疫反应。 本研究成功原核表达并纯化了三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白，重组蛋白与我国无形体病人阳性血清存在免疫反应。三株嗜吞噬细胞无形体AnkA重组蛋白与免疫小鼠多克隆抗体之间存在交叉反应，通过Westernblot和ELISA方法得到人源无形体不同分离株AnkA蛋白质之间的免疫原性差异不显著，表明它们之间的空间结构及其相似，抗原表位差异较小；通过与立克次体目成员免疫反应存在免疫交叉反应表明该重组蛋白无较好的特异性，不适合应用于鉴别诊断。
【关键词】：嗜吞噬细胞无形体 AnkA蛋白 原核表达 免疫原性 交叉反应性
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392.1
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文缩略词表10-11
• 前言11-12
• 第一篇 综述 人粒细胞无形体病（HumanGranulocyticAnaplasmosis）和嗜吞噬细胞无形体（A.phagocytophilum）12-22
• 1 微生物学，病理学和致病机理12-14
• 1.1 分类和命名12-13
• 1.2 微生物学和致病机理13-14
• 2 生态学和流行病学14-16
• 2.1 生态学14-15
• 2.2 流行病学15-16
• 3 临床表现和诊断16-18
• 3.1 临床表现16-17
• 3.2 诊断17-18
• 4 治疗18
• 5 AnkA蛋白18-22
• 第二篇 试验研究22-56
• 实验一 嗜吞噬细胞无形体AnkA重组蛋白的克隆表达和鉴定22-46
• 摘要22
• 1 材料和方法22-35
• 1.1 材料22-24
• 1.2 实验方法24-35
• 2 实验结果35-44
• 2.1 蛋白序列分析35-39
• 2.2 ankA目的基因的扩增及纯化39
• 2.3 pEASY-T（+）-ankA重组质粒鉴定39-40
• 2.4 pEASY-T（+）-ankA质粒和表达质粒pET30a（+）双酶切40-41
• 2.5 酶切产物的纯化41
• 2.6 ankA目的基因的测序及对比结果41
• 2.7 小量诱导表达41-42
• 2.8 AnkA重组蛋白的纯化42-43
• 2.9 重组蛋白的飞行时间质谱分析结果43
• 2.10 免疫印迹43-44
• 3 讨论44-46
• 3.1 蛋白质二级结构预测的意义44-45
• 3.2 融合蛋白与包涵体45-46
• 实验二 三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白免疫原性差异性研究46-56
• 摘要46
• 1 材料和方法46-51
• 1.1 材料46-47
• 1.2 实验方法47-51
• 2 实验结果51-55
• 2.1 ELISA预实验51
• 2.2 小鼠免疫抗体水平的检测结果--ELISA以及Westernblot反应51-52
• 2.3 重组蛋白与立克次体目常见致病菌交叉反应—ELISA以及Westernblot反应52-53
• 2.4 AnkA重组蛋白交叉免疫分析—ELISA以及Westernblot反应53-55
• 3 讨论55-56
• 第三篇 试验结论56-58
• 参考文献58-66
• 致谢66-68
• 附录68-70
• 作者简介70-71
• 导师评阅表71

【共引文献】

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