抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的初步研究

发布时间：2017-05-18 22:04

  本文关键词：抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 鲍曼不动杆菌属于非发酵革兰阴性杆菌,广泛存在于自然界中,属条件致病菌,在医院的环境中分布广泛且可长期存活。以引起呼吸道感染为主,也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。医疗环境中的氧气湿化瓶、呼吸机、输液设备、空调系统以及病人和医务人员皮肤均可被此菌污染而引起患者感染。对在院患者及医护人员有很大的威胁,尤其是对重症监护病房和烧伤病房中的患者,因其抵抗力低下或者皮肤大面积缺失等,成为了细菌侵袭机体的主要因素。 近年来,随着鲍曼不动杆菌医院感染率、检出率及临床分离率的逐年上升,其耐药性亦呈增长趋势。甚至出现了广泛耐药鲍曼不动杆菌、全耐药鲍曼不动杆菌,给临床治疗带来了很大的挑战。研究表明：鲍曼不动杆菌基因组的特性使其具有快速获得和传播耐药性的能力,近年来多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈广泛流行传播。 临床上对于鲍曼不动杆菌感染的治疗,常常束手无策。因为鲍曼不动杆菌不仅对常用的阿米卡星、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素的耐药率均高达95%以上,而且对第三代和第四代头孢菌素的耐药率亦可高达70%。虽然部分鲍曼不动杆菌菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮-舒巴坦和多粘菌素仍有一定的敏感性,但随着抗菌药物大量而且广泛使用,耐药的鲍曼不动杆菌菌株也越来越多,耐药率也逐年上升。目前,虽然对鲍曼不动杆菌的耐药机制尚不完全明确,但近年来关于鲍曼不动杆菌耐药机制的报道越来越多,大多数研究均表明,鲍曼不动杆菌的主要致病因素与其产生的生物膜有关。 细菌生物膜是一个具有结构性、协调性和功能性的高度组织群体,其相关感染因为对抗生素的耐药性极强成为临床难治性感染的重要原因之一。几乎每一种细菌都可以以生物膜的形式存在,国外相关研究证实至少65%的人类细菌感染疾病与生物膜有关。慢性中耳炎、中耳胆脂瘤、慢性腺样体炎等疾病的发病原因已被证实与生物膜的形成有关。生物膜是由多个细菌不可逆地黏附于机体或物体表面,被自身分泌的基质包裹,形成细菌群落。相比游离状态的细菌,细菌生物膜内的细菌对抗菌药物的敏感性明显降低,这可能与生物膜的结构或者是细菌生物膜内的细菌生理结构发生了改变有关,使得生物膜外的抗菌药物难以进入生物膜深部。以前一直认为是由于生物膜介导才使得抗菌药物难以渗透到生物膜内部,但一些研究否认了这一假说。研究表明,喹诺酮类药物能迅速渗透到绿脓杆菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部,四环素能迅速渗透入大肠杆菌生物膜内部,万古霉素能迅速渗透入金黄色葡萄球菌生物膜内部。目前能确认的只有氨基糖苷类药物,因为生物膜基质带负电荷,而氨基甙类药物带正电荷,因此,其很难渗入生物膜内部。此外,由于许多抗菌药物对繁殖期的细菌有很强的杀灭作用,如青霉素类药物、头孢菌素类药物及其一些碳青霉烯类药物等。由于受氧气、营养物质的匮乏及密度感应系统的调节等的影响,使得生存于细菌生物膜内部的细菌,生长、繁殖率下降,从而影响抗菌药物对其作用。因此,在抗菌药物的作用下,细菌生物膜内相对敏感的细菌可能会被杀死,但耐药性强的细菌会继续存在,而且一旦停止使用抗菌药物,这些耐药细菌会重新繁殖、生长。细菌生物膜使细菌具有极高的耐药性和免疫逃逸能力,可以逃避机体的免疫攻击和抗生素的杀灭,并进一步成为耐药菌,这也是是导致慢性持续性感染以及感染难以治愈的重要原因。所以,寻求一种从根本上控制、解决细菌感染和耐药的药物,对每一个临床工作者来说,是十分重要的。 随着分子生物学理论及基因工程技术的发展,探索一种广谱、无耐药性或者低耐药性的新型抗菌药物越来越受到人们的重视。抗菌肽是在动物主动防御体系中发现的一种多肽,由宿主基因编码,是动物固有免疫的重要成分。抗菌肽是生物体免疫防卫系统产生的一类小分子活性多肽,是生物体内固有免疫的重要组成部分,这类活性多肽多数具有热稳定性、酸碱适应性及广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞等特点,主要分布于细菌、病毒、各种动物和植物体内。近年来的实验表明,LL-37是迄今在人体发现的Cathelicidins家族的唯一成员,hCAP-18酶解后释放出的C端片段,成为LL-37,因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)和氨基酸残基总数为37而得名。LL-37在人体组织中广泛存在,这类活性多肽主要由中性粒细胞、各种上皮细胞等产生,具有热稳定性、酸碱适应性,能抗菌、调节免疫反应、趋化作用、血管生成的刺激作用及组织再生和细胞因子释放。相关研究证实了抗菌肽LL-37对大肠杆菌、绿脓杆菌、肠球菌以及金葡菌具有抑菌作用,而且对大肠杆菌产生的生物膜也有一定的破坏作用。但是关于抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的实验研究尚未多见。本文旨在研究LL-37对浮游性鲍曼不动杆菌及其生物膜的影响,为将来在临床感染的控制和新的抗菌药物的研发提供科学的依据。 研究目的 1、观察鲍曼不动杆菌形成生物膜的能力,探索在体外建立鲍曼不动杆菌生物膜模型的方法； 2、检测抗菌肽LL-37的MIC； 3、观察抗菌肽LL-37对浮游型鲍曼不动杆菌及其生物膜的影响。 研究方法 1、生物膜形成的定性测定：在24孔组织培养板上建立鲍曼不动杆菌生物膜预模型。挑取AB菌落于5ml LB培养液中,37℃恒温振荡培养。8小时后用比浊仪调整菌液浓度约为1.0×108CFU/ml,吸取200gl菌液加入已加12x12mm玻片24孔板,每孔内加入2ml LB培养基,37℃恒温培养,每24h更换培养液1次,5d后将盖玻片从培养基中移除,用无菌PBS轻洗3次,以除去附着的浮游菌,加热固定后用结晶紫染色观察。培养孔中的浮游菌做结晶紫染色观察。 2、测定LL-37MIC:根据临床实验室标准化协会所制定方法测定MIC。 3、LL-37对生物膜作用 (1)扫描电镜观察生物膜结构将无菌吸痰管剪成1.0cm大小,高压灭菌后置于含上述菌液的24孔板中,37℃恒温培养5d,每24小时更换培养液。5d后随机分为实验组和对照组,实验组加入20μg/ml LL-37溶液,对照组加无菌双蒸水。24小时后用无菌PBS溶液轻轻漂洗数次,2.5%戊二醛溶液固定,置冰箱4℃保存。经过乙醇梯度脱水后,将样品放入临界点干燥器内,干燥后的标本放入高真空蒸发器中,离子喷溅仪喷金后待测。运用扫描电子显微镜观察硅胶膜上鲍曼不动杆菌生物膜的超微结构。(2)结晶紫染色法定量检测生物膜96孔板内加入200μl菌液,每24小时换LB培养液,37℃恒温培养；5d后在各孔内分别加入不同浓度LL-37(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、(无菌双蒸水),37℃恒温放置24小时后,用无菌PBS溶液轻轻漂洗96孔板,自然风干后,加入1%结晶紫溶液2ml,室温染色20min,蒸馏水洗去染液,自然风干后,加入95%乙醇,放置10min。用酶标仪测定570nm波长处吸光度(A)值,以空白酒精做对照。 实验结果 1、在没有外界因素诱导的条件下,鲍曼不动杆菌在盖玻片上培养5d后形成成熟的生物膜,经结晶紫染色后肉眼可见玻片表面覆盖有紫色致密物质,高倍镜下观察,可见细菌聚集生长,形成膜状集落；培养基中的浮游菌经革兰染色后在高倍镜下观察,细菌成散在分布。 2、成功测得抗菌肽LL-37对浮游型鲍曼不动杆菌的MIC的值为64μg/ml。 3、(1)扫描电镜图片明确地观察到鲍曼不动杆菌可以黏附在硅胶吸痰管表面,并形成生物膜,证实鲍曼不动杆菌可以生物膜菌的方式生存,与黏附物接触第5天形成成熟的生物膜,与以往报道3-5天相一致。并且可见实验组生物膜相比对照组结构明显稀疏。 (2)LL-37浓度为2.5μg/ml时吸光度明显降低,即生物膜量较0μg/ml、1.25μg/ml组明显减少,表明此浓度下LL-37即可抑制生物膜形成,并随着LL-37浓度的增加吸光度逐渐降低。当LL-37浓度增至10μg/ml、20μg/ml时,两组之间差异无统计学意义。 研究结论 1、鲍曼不动杆菌在盖玻片上培养5d后形成成熟的生物膜,与以往报道3-5d相一致,证明已成功建立体外鲍曼不动杆菌生物膜模型。 2、测得抗菌肽LL-37的最小抑菌浓度为64μg/ml,与之前研究结果4-64μg/ml一致。 3、当抗菌肽LL-37浓度为2.5μg/m(远低于其最小抑菌浓度时)即可破坏鲍曼不动杆菌生物膜结构的浓度。
【关键词】：抗菌肽LL-37 细菌生物膜 鲍曼不动杆菌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-24
• 材料与方法24-28
• 一、主要实验器材24
• 二、主要实验材料和试剂24-25
• 三、实验方法25-28
• 实验结果28-33
• 1、鲍曼不动杆菌生物膜模型建立28-29
• 2、抗菌肽LL-37对浮游型鲍曼不动杆菌的MIC29-30
• 3、抗菌肽LL-37对成熟鲍曼不动杆菌生物膜的作用30-33
• 讨论33-43
• 总结43-44
• 参考文献44-50
• 文献综述50-58
• 参考文献55-58
• 攻读学位期间成果58-59
• 附录59-60
• 致谢60-61

【参考文献】

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  本文关键词：抗菌肽LL-37对鲍曼不动杆菌生物膜作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：377207