细胞珠蛋白检测方法的建立及其在大鼠肝脏纤维化模型中的应用

发布时间：2017-05-18 22:05

  本文关键词：细胞珠蛋白检测方法的建立及其在大鼠肝脏纤维化模型中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：全世界有超过5%以上的人口患有与肝硬化相关的疾病,在许多国家,肝硬化已经成为一种较普遍的致死病因。肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段,是肝脏受到慢性损伤时,细胞外基质(ECM)可逆性沉积的创伤愈合过程。随着对细胞生物学及生物化学的深入的研究,认为肝纤维化的形成是慢性肝损伤过程中多种细胞密切联系,并通过多种细胞因子及细胞外基质蛋白等相互作用、相互影响组成的网络来调控的。肝脏纤维化危害极大,由于肝组织结构的破坏,造成门静脉系统血管阻力增大,形成门静脉高压,导致脾肿大、腹水生成和胃底食管静脉曲张,有上消化道曲张静脉破裂出血的潜在危险。而且由于肝纤维化使正常肝细胞之间的血液微循环通道因纤维组织成分的沉积而造成循环障碍,影响肝细胞的血液供应,使因炎症受损的肝细胞不易修复甚至加重损伤,直至功能正常的肝细胞越来越少,最后导致肝硬化,甚至发展为肝癌。对肝纤维化的治疗主要从几点出发：(1)去除病因治疗。肝损伤严重的部位通常会产生纤维化,而炎症和损伤的严重程度与肝纤维化成正相关,如果早一步去除病因,如病毒、酒精及毒物,这是预防肝硬化最有效的治疗措施。(2)抑制肝星状细胞的激活和增生。(3)增加肝脏细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)的降解。如基质金属蛋白酶及其抑制剂TIMP,或使用尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂。(4)增强肝细胞再生。如肝细胞生长因子(HGF)不仅能刺激肝脏再生,还能阻止肝纤维化的发生并加速其恢复。(5)干细胞治疗。已有研究证实间充质干细胞(MSC)能够通过诱导HSC凋亡起到减轻肝纤维化作用。虽然以上药物在治疗肝硬化过程中有效,但是副作用也大,如肝细胞生长因子有致肿瘤的危险,而尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂可能会引起出血或是血栓形成。 现在肝脏纤维化的诊断主要通过三种方法：一是病理活检诊断,这仍然是肝脏纤维化诊断的“金”标准,作为一种创伤性检查,具有明显的局限性,具有一定的风险,患者不易接受,很难保证一次取材能反应肝脏的全貌,有一定的假阴性。二是血清学诊断：主要是肝脏纤维化四项(PCⅢ、LN、HA、CIV),基质金属蛋白酶(MMP2)及其抑制物(TIMP1)以及细胞因子的检查,但是缺少肝脏特异性。三是影像学诊断：主要利用B超、CT以及MRI进行检查。虽然不能直接诊断肝脏纤维化,但仍有一定的使用价值。还有基于生化指标和超声探测肝脏弹性的Fibrotest和Fibroscan技术,可以无创、快速、定量估计肝脏纤维化程度,但却无法准确区分相邻的纤维化分期,故尚不能完全取代肝活组织病理学检查。因此急需寻找一种全新的方法或指标来诊断肝脏纤维化。 目前认为,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化发生发展中起主导作用。在各种致病因素作用下,静止期HSC被激活并增殖、转化为肌成纤维样母细胞,合成和分泌ECM上调,同时合成和释放大量基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs),使间质胶原酶等蛋白酶活性降低,ECM降解减少,最终导致ECM积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化。鉴于HSC在肝纤维化发病机制中的主导作用,大多数抗肝纤维化研究都以HSC为靶标。Kawada等在进行大鼠星状细胞的蛋白质组学研究时,发现了一种新蛋白stellate cellactivation-assosiated protein (STAP)。该蛋白在肝星状细胞活化的过程中有明显的上调表达,并且只在肝星状细胞中表达,对其生化特性的研究表明它是一种内源性的过氧化物酶,能够分解过氧化氢和脂质过氧化物,而后两者据报道能激活肝星状细胞,促进肝脏纤维化的形成。通过同源比对,在人的肝脏基因组中又发现了人源肝星状细胞激活相关蛋白(human Stellate cell activation-associated protein hSTAP),其核苷酸序列与鼠源肝星状细胞激活相关蛋白(rat Stellate cell activation-associatedprotein rSTAP)的核苷酸序列有97%的同源性,该基因(GenBank AB057769)位于17号染色体,编码190个氨基酸残基。STAP目前在国际上也被命名cytoglobin (Cygb)或histoglobin,它属于一个新发现的hexacoordinate globin超家族的成员。我国学者Ruian Xu等(2006)构建了大鼠Cygb的重组腺相关病毒表达载体,以基因治疗的方式,研究了大鼠Cygb对肝纤维化的治疗作用,研究结果显示,在大鼠的星状细胞中过表达rCygb可以缓解氧化压力,抑制肌成纤维样母细胞的分化,同时减少细胞外基质的沉降。香港学者Man KN (2008)在小鼠的动物实验证实Cygb在四氯化碳引起的肝纤维化时表达量增加,并可能作为早期肝纤维化的标志物。 基于此我们设计了以下实验,通过建立Cygb的检测方法检测肝脏纤维化模型中Cygb的含量变化,探索其作为肝脏纤维化检测指标的可能性。 Cygb的检测我们建立的是双抗夹心ELISA法。利用构建好的工程菌制备重组人源(recombinant human Cytoglobin)细胞珠蛋白rhCygb,经SDS-PAGE纯化再回收,再经SDS-PAGE检测纯度,并进行Western-blot鉴定。单克隆抗体为实验室先前制得,并用HRP标记。双抗夹心ELISA的方法需要对抗体进行配对筛选,筛选出OD值最高的一对。并进行大量制备、纯化,再通过正交试验确定抗体的包被浓度和酶标抗体的稀释度,以纯化的rhCygb做校正抗原做标准曲线,以线性范围、准确性、灵敏度评价ELISA方法。 肝脏纤维化模型的构建我们采用SD雄性大鼠皮下注射CCl4的方法,通过注射不同浓度梯度的CCl4分别构建轻度、中度和重度肝脏纤维化模型,通过检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝脏纤维化四项(LN、HA、PⅢNP、 IV-C)以及病理切片确定模型的构建。最后检测肝纤维化各组血清Cygb含量,数据采用spss13.0处理。 结果显示,rhCygb经纯化后纯度达到95%以上,可作为校正抗原。rhCygb单克隆抗体经protein G纯化,纯度达到90%以上,HRP标记率为50%-60%。配对实验显示以5①为包被抗体,2③为检测抗体为最佳组合,正交试验确定以2μg/ml包被,酶标抗体1/1600稀释为最佳条件,以此建立标准曲线,以rhCygb浓度的对数值为横坐标,相应吸光值为纵坐标绘制工作曲线,求得曲线方程为Y=0.3395X—0.1695,在0-1500ng具有良好的线性,相关系数R2为99.41%,检测限为8.7ng。大鼠肝脏纤维化模型构建成功,病理切片显示不同浓度CCl4能诱导不同程度的纤维化模型,经Knodell指数评分显示模型组分别为轻度、中度和重度肝脏纤维化。模型组与正常组各指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及肝纤维化四项)有显著性差异(P0.05),但中度模型组与重度模型组之间的层粘蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PⅢNP)无统计学差异,各模型组之间的Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)无统计学差异。层粘蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PⅢNP)与肝脏纤维化程度的相关系数分别为0.66、0.826、0.741,P值均小于0.01。而Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)与肝脏纤维化程度无相关性。正常组血清样本中Cygb的含量为36.11±5.01ng/ml,轻度模型组血清样本的细胞珠蛋白的含量为119.11±13.00ng/ml,中度模型组血清样本的细胞珠蛋白的含量为161.24±14.46ng/ml,重度模型组血清样本的细胞珠蛋白的含量为203.67±29.33ng/ml。各组间两两比较皆有显著性差异(P0.01),细胞珠蛋白含量与肝脏纤维化程度相关系数为0.906。 以上结果表明,本研究成功建立了rhCygb双抗夹心ELISA方法,经试验可以成功检测大鼠血清中Cygb;成功构建了不同程度的肝脏纤维化模型,可用于动物模型的肝纤维化研究；相对于肝脏纤维化四项,细胞珠蛋白的变化更能反映肝脏纤维化的不同程度,可作为肝脏纤维化的诊断指标。
【关键词】：细胞珠蛋白 检测方法 大鼠 肝纤维化 应用
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2;R-332
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-19
• 第一部分 双抗夹心ELISA的建立19-35
• 1 实验材料19-23
• 1.1 主要仪器设备19-20
• 1.2 主要试剂20
• 1.3 主要试剂的配制20-23
• 2 实验方法23-29
• 2.1 重组人员细胞珠蛋白的表达和纯化23-28
• 2.2 抗体的标记以及工作浓度的测定28
• 2.3 配对抗体的筛选28
• 2.4 佳包被浓度和酶标抗体稀释度的确定28
• 2.5 双抗夹心ELISA的建立28
• 2.6 方法学评价28-29
• 3 实验结果29-34
• 3.1 rhCYGB的制备、纯化和鉴定29-31
• 3.2 克隆抗体的纯化31
• 3.3 抗体的标记及质量鉴定31
• 3.4 配对抗体筛选结果31-32
• 3.5 包被浓度和酶标抗体稀释度的确定32-33
• 3.6 标准曲线的绘制33
• 3.7 方法学的评价33-34
• 4 小结34-35
• 第二部分 肝脏纤维化模型的构建及样本的检测35-47
• 1 实验材料35-36
• 1.1 主要仪器设备35
• 1.2 主要试剂35-36
• 1.3 主要试剂的配制36
• 1.4 实验动物36
• 2 实验方法36
• 2.1 肝脏纤维化的诱导36
• 2.2 样本采集、保存与检测36
• 2.3 数据处理36
• 3 实验结果36-45
• 3.1 病理切片36-38
• 3.2 谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肝纤维化四项38-44
• 3.8 Cygb的检测及数据处理44-45
• 4 小结45
• 5 讨论45-47
• 5.1 肝脏纤维化模型诱导方法45-46
• 5.2 肝脏纤维化四项选择46-47
• 全文小结47-48
• 参考文献48-55
• 附录 中英文缩略词对照55-56
• 致谢56-57

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