不同亚型重组人白细胞介素8蛋白表达、纯化与活性检测

发布时间：2017-05-20 04:09

  本文关键词：不同亚型重组人白细胞介素8蛋白表达、纯化与活性检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：白细胞介素一8 (Interleukin-8, IL-8)是一种多功能性的细胞因子,属于趋化因子CXC亚家族的一员,是体内炎症反应应答的主要介质之一。除常规生化检测方法之外,尚未有报道利用蛋白质片段互补检测(Protein FragmentComplementation Assay, PCA)技术对IL-8的生物学活性进行测定。本文利用基因工程技术实现重组人源性IL-8的高效表达、纯化,并利用PCA技术实现重组IL-8活性检测。方法：将3种不同亚型的重组人IL-8基因片段分别与表达载体pME-15-6His和pET-32a连接,转入哺乳动物细胞HEK 293F和大肠杆菌BL2l(DE3),进行IL-8的表达。采用IMAC亲和层析柱对重组人IL-8进行纯化。根据PCA技术,构建了Split-TEV GPCR激活检测系统,对纯化的目的蛋白进行了细胞内生物学活性检测。结果：成功构建了真核表达载体pME-15-6His/IL-8formI,前体IL-8基因在HEK293F中正确分泌表达,其N端信号肽(残基1-20)被切除,经过纯化得到的重组蛋白为成熟的IL-8 form I(残基21-99)；成功构建了原核表达载体pET-32a/IL-8 formII和pET-32a/IL-8 form III,N端融合了Trx标签的重组蛋白在大肠杆菌中正确表达,经过纯化和重组肠激酶酶切得到的重组蛋白为IL-8 form II(残基23-99)和IL-8form III(残基28-99)。纯化后的重组人IL-8对其天然受体IL8RB具有明显的激活活性,其ECso值分别为：12.32ng/ml (Form Ⅰ),15.14 ng/ml (Form Ⅱ)和2.85ng/ml (Form Ⅲ)。结论：成功构建、表达和纯化了具有生物学活性的3种不同亚型的重组人IL-8,为进一步的理论研究和大批量生产奠定了基础。
【关键词】：白细胞介素-8 哺乳动物细胞 活性检测 蛋白质片段互补 Split-TEV
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 第一章 重组人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表达和纯化7-25
• 前言7
• 1.1 实验材料与仪器7-9
• 1.1.1 菌株与载体7-8
• 1.1.2 工具酶与试剂8
• 1.1.3 主要仪器设备8-9
• 1.2 实验方法9-16
• 1.2.1 重组人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ表达载体构建9-12
• 1.2.2 重组人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白表达12-14
• 1.2.3 重组人IL-8 formⅠ、formⅡ和form Ⅲ蛋白纯化14-16
• 1.3 实验结果与讨论16-24
• 1.3.1 不同IL-8亚型的克隆及载体构建16-17
• 1.3.2 HEK 293F细胞瞬时表达重组人IL-8 formⅠ蛋白17-18
• 1.3.3 大肠杆菌表达IL-8 FormⅠ和IL-8 FormⅡ重组蛋白18-20
• 1.3.4 重组人IL-8蛋白的纯化20-24
• 1.4 结论24-25
• 第二章 重组人IL-8蛋白细胞内生物学活性检测25-37
• 前言25
• 2.1 实验材料与仪器25-26
• 2.1.1 菌株、载体、基因模板25
• 2.1.2 工具酶与试剂25
• 2.1.3 主要仪器设备25-26
• 2.2 实验方法26-29
• 2.2.1 引物设计26-27
• 2.2.2 真核表达载体构建27-28
• 2.2.3 不同亚型的重组人IL-8蛋白活性测定28-29
• 2.3 实验结果与讨论29-36
• 2.3.1 Split-TEV GPCR测活检测系统原理29-31
• 2.3.2 Split-TEV GPCR测活检测系统真核表达载体的构建31-34
• 2.3.3 转染与生物学活性检测34-36
• 2.4 结论36-37
• 参考文献37-39
• 综述39-49
• 参考文献46-49
• 致谢49-50

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本文编号：380621