人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测试剂的研制

发布时间：2017-05-20 13:13

  本文关键词：人巨细胞病毒PP65抗原ELISA检测试剂的研制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的制备重组PP65多克隆抗体（pAb），研制检测PP65抗原血症的ELISA检测试剂。 方法表达及纯化重组PP65蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，Western Blot鉴定重组PP65蛋白的抗原性。重组PP65蛋白免疫新西兰大耳白兔和SD大鼠，制备相应pAb。间接ELISA测定pAb效价，饱和硫酸铵沉淀法纯化pAb。玻片凝集实验分析pAb与是否与环境微生物发生交叉反应。探索pAb和重组PP65相互结合的各自最佳浓度、最适包被抗体与检测抗体的搭配方案，选择适合的包被温度、包被时间、封闭液以及底物显色时间等，优化检测试剂的条件，建立试剂的检测步骤及PP65抗原标准曲线，并确定试剂精密度及检出下限。通过对101份临床疑似HCMV感染标本的检测，并与市售HCMV-IgM（ELISA）试剂以及HCMV-DNA（FQ-PCR）试剂的检测结果进行比较，分析自制PP65抗原ELISA检测试剂的敏感性与特异性。用自制试剂检测单纯疱疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血标本，分析自制试剂是否非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原。检测并分析比较PP65抗原在单个核细胞与多形核细胞中的表达情况。 结果纯化得到重组PP65蛋白，蛋白浓度为0.21mg/ml。经Western Blot鉴定，该蛋白可与PP65单克隆抗体特异性结合。免疫所得兔血清pAb效价达1:400000，大鼠血清pAb效价1:20000。玻片凝集实验提示制备的两种pAb均不与环境空气中细菌以及常见葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌反应，说明pAb特异性较高。检测试剂的条件优化，确定了1:2000大鼠pAb为包被抗体，，1:20000兔pAb为检测抗体，2%的BSA为封闭液，4℃包被12h，底物显色15min等检测条件，建立了检测PP65抗原血症的ELISA方法和PP65抗原标准曲线。研制所得HCMV PP65抗原ELISA检测试剂的检出下限为5ng/ml，批内精密度与批间精密度均小于10%。自制试剂与市售HCMV-IgM（ELISA）试剂相比检测结果有差别（P0.05），与市售HCMV-DNA（FQ-PCR）试剂相比，检测结果无差别（P0.05），相对于HCMV-DNA（FQ-PCR）试剂的一致率为97.0%。自制试剂对单纯疱疹病毒1型、2型以及EB病毒感染血标本的检测结果均为阴性，排除了试剂非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗原的可能。经分析PP65抗原在单个核细胞与多形核细胞中的表达量无显著性差异（P0.05），提示自制试剂的检测标本取外周白细胞抗原即可。 结论建立了检测HCMV PP65抗原的间接双抗夹心ELISA方法，试剂具有较好的敏感性、特异性、稳定性和重复性。
【关键词】：人巨细胞病毒 PP65抗原 pAb ELISA
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-9
• 前言9-11
• 第一部分 人巨细胞病毒 PP65_322-561蛋白的原核表达及鉴定11-20
• 材料11-14
• 方法14-17
• 结果17-20
• 第二部分 PP65多克隆抗体的制备及PP65 抗原ELISA检测试剂的研制20-32
• 材料20-21
• 方法21-25
• 结果25-32
• 第三部分 HCMV PP65 抗原 ELISA 检测试剂的应用32-36
• 材料32
• 方法32-34
• 结果34-36
• 讨论36-38
• 结论38
• 参考文献38-41
• 综述41-50
• 参考文献45-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【参考文献】

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本文编号：381715