人乳头瘤病毒（HPV）衣壳蛋白L1五聚体形成的体外可控自组装

发布时间：2017-05-20 14:17

  本文关键词：人乳头瘤病毒（HPV）衣壳蛋白L1五聚体形成的体外可控自组装，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人乳头瘤病毒（HPV）是无包膜双链DNA病毒，其衣壳由晚期表达结构蛋白L1和L2组成。在适当的条件下，L1蛋白能形成五聚体（Pentamer），并由72个五聚体自组装（self-assembly）成类病毒颗粒（Virus-like Particles,VLPs）。利用真核细胞、酵母或大肠杆菌均可有效表达HPV L1，且在没有L2参与下L1蛋白自身也可以在体外自组装成VLPs。由于妇女宫颈癌的发生直接与HPV的感染和复制有关，目前化学家和生物学家正在试图从多角度去了解、认识和模拟HPV病毒的繁衍机制，希望能从根本上揭示这一病毒的生命活动规律，达到有效预防或制服它的目的。利用目前的方法所表达出的L1均是以五聚体或VLPs的形式存在，因此还没有人拿到过具有完整结构的L1蛋白单体，对其由单体到五聚体的形成过程及调控因素更是知之甚少。基于此，我们提出了HPV L1五聚体自组装的研究思路，，并在体外实施由单体到五聚体、再到VLPs的多级、可控自组装。 通过研究我们发现GST融合表达的L1蛋白（GST-L1）能正确折叠，但由于N-末端GST的位阻效应迫使它只能以单体形式存在；除去GST标签后的L1仍然能自组装成五聚体。在此我们利用稳态光散射(SLS)技术首次实现对HPV L1蛋白由单体到五聚体的形成过程的原位监控，也为其它抗病毒制剂调控五聚体的形成提供了一条新的监测途径。 基于上述发现，我们引进了有机小分子抑制剂对五聚体形成机制进一步研究。通过实验发现柱芳烃（pillarene）和杯芳烃(calixarene)不仅对HPV L1上的赖氨酸和精氨酸具有很好的选择性，而且对抑制五聚体形成具有很明显的效果。接下来我们还对柱芳烃和杯芳烃的抑制效率做了进一步比较，发现柱芳烃可以更有效的抑制五聚体的形成，而且两者与HPV L1结合能力以及分子作用机制也有所不同。 紧接着我们精心设计了三种不同的蛋白纯化方案，发现共纯化的伴侣蛋白GroEL能帮助L1蛋白进行正确折叠，从而促进五聚体形成，并最终提高类病毒颗粒（VLPs）的产量。这一发现揭示了伴侣蛋白对HPV L1五聚体形成的作用机制，并对未来疫苗的发展提供了独特的生物技术支持。
【关键词】：人乳头瘤病毒 自组装 单体 五聚体 抑制剂 伴侣蛋白
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 提要4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-21
• 1.1 人乳头瘤病毒简介12-15
• 1.2 人乳头瘤病毒的自组装与解组装15-16
• 1.3 人乳头瘤病毒衣壳蛋白与有机小分子的主客体相互作用16-18
• 1.4 伴侣蛋白简介18-19
• 1.5 本文研究的设计思路19-21
• 第二章 体外监控HPV16型主衣壳蛋白L1单体到五聚体的组装过程21-32
• 2.1 引言21
• 2.2 实验部分21-24
• 2.2.1 样品和试剂21-22
• 2.2.2 实验仪器22-23
• 2.2.3 实验方法23-24
• 2.3 结果与讨论24-30
• 2.3.1 快速蛋白液相色谱检测25-26
• 2.3.2 L1 单体、五聚体的二级结构与热稳定性分析26-27
• 2.3.3 蛋白颗粒粒径检测27
• 2.3.4 蛋白颗粒形貌表征27-28
• 2.3.5 五聚体形成的自组装监控28-30
• 2.4 本章小结30-32
• 第三章 有机小分子CP5A和SC4A有效抑制HPV 16L 1五聚体的形成32-49
• 3.1 引言32-33
• 3.2 实验部分33-37
• 3.2.1 样品和试剂33-34
• 3.2.2 实验仪器34-35
• 3.2.3 实验方法35-37
• 3.3 结果与讨论37-48
• 3.3.1 利用 SLS 监控 CP5A 抑制五聚体形成37-38
• 3.3.2 CP5A 和 SC4A 对氨基酸残基的选择性38-42
• 3.3.3 CP5A 对五聚体产量的影响42-44
• 3.3.4 CP5A 和 SC4A 抑制效果的比较44-47
• 3.3.5 晶体结构分析47-48
• 3.4 本章小结48-49
• 第四章 伴侣蛋白GroEL在HPV L1 蛋白折叠与五聚体形成的过程中发挥的关键作用49-59
• 4.1 引言49
• 4.2 实验部分49-52
• 4.2.1 样品和试剂49-50
• 4.2.2 实验仪器50-51
• 4.2.3 实验方法51-52
• 4.3 结果与讨论52-58
• 4.3.1 第一种纯化方案52-55
• 4.3.2 第二种纯化方案55-56
• 4.3.3 第三种纯化方案56-57
• 4.3.4 伴侣蛋白对 L1 产量以及对五聚体形成效率的影响57-58
• 4.4 本章小结58-59
• 参考文献59-69
• 附录69-73
• 作者简介及已发表成果73-74
• 致谢74

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本文编号：381901