间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究

发布时间：2017-05-20 20:18

  本文关键词：间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：对脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stemcells，hUC-MSCs）及人汗腺细胞（human sweat gland cells, h-SGCs）分离培养，找出脐带间充质干细胞的体外合适培养环境，，探讨利用细胞融合技术将脐带间充质干细胞和人汗腺细胞在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）的作用下诱导融合，研究合核细胞的生物学特性，为汗腺再生探索一条新的方法和途径。 方法： 1UC-MSCs的分离、培养和鉴定：获取无菌足月剖宫产健康胎儿脐带，剔除血管（两条动脉、一条静脉）并用镊子取出脐带中的沃顿胶组织(Wharton’s Jelly)剪成大小约1mm3的组织块。将组织块按适当密度接种于培养板中，当镜下观察到组织块周围有呈集落生长的成纤维状细胞时，去除组织块，添加培养液继续培养。当细胞达到一定密度时适时传代，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化，按104/cm2传代培养。流式细胞术检测细胞表面抗原表达情况。 2UC-MSCs的标记：将第二代脐带间充质干细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，用稀释液C重悬细胞,迅速加入到PKH26工作液（PKH26染料250倍稀释）中染色1-5min，血清终止反应，DMEM/F12完全培养基洗涤2次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记结果。倒置相差显微镜下观察标记后细胞形态。 3UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：用MTT比色法分别检测不同浓度的胎牛血清在490nm处，吸光度值的均数(OD值)。同样用MTT比色法分别检测干细胞不同种植密度在490nm处，吸光度值的均数(OD值)。观察传代后不同时期干细胞的生长情况并绘制生长曲线。 4汗腺细胞(h-SGCs)的培养：取正常全层头部皮肤去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小组织块，用Ⅱ型胶原酶消化法获得汗腺组织，汗腺培养基培养，大部分汗腺团块汗腺细胞(h-SGCs)贴壁爬出后，进行换液，已后3-4天换液一次。对培养的细胞进行免疫组化检测，看CEA和CK19表面抗原的表达情况。 5汗腺细胞的标记：将第一代汗腺细胞消化后制单细胞悬液，离心，取细胞沉淀，加入CFDASE细胞标记液和CFDASE储存液（2X）进行标记，完全培养液（含血清）终止标记，洗涤三次后正常培养(具体操作步骤按说明书进行)。在荧光显微镜下观察标记效果。 6间充质干细胞/汗腺细胞的融合、筛选及干细胞/汗腺细胞融合体的鉴定：融合方法：分别取对数生长期已标记的P3代脐带间充质干细胞和已标记的P0代汗腺细胞，用5ml GENMED清理液(reagentA)清洗，离心，去上清后用GENMED清理液(reagentA)洗涤，取细胞沉淀加入GENMED融合液（reagent B）进行融合，用GENMED清理液(reagentA)洗涤终止反应，去上清后正常培养。筛选方法：将标记后的融合细胞稀释置于96孔板，用荧光显微镜观察，标记出红色荧光和绿色荧光均显示的孔，将标记孔内的细胞汇入到一个孔内培养，视细胞生长情况及时检测并扩大培养。鉴定方法：将培养的融合细胞分别进行免疫组化法检测CEA和CK19表面抗原的表达情况和流式细胞术检测融合细胞表面标志物的表达率。同时以汗腺培养基培养的UC-MSCs作为对照，检测CEA和CK19阳性细胞的比例。 结果： 1UC-MSCs分离、培养、鉴定：培养5-7d后,已有少量脐带组织块爬出成纤维样细胞。二周后，可见部分组织块爬出成纤维样细胞，给予换液。之后2-3天给予换液一次，传1、2代(P1、P2)的UC-MSCs呈长梭行，形态均一。培养至九代(P9)的UC-MSCs，细胞生长缓慢，形态开始发生变化，折光性变得较差，培养至十二代的(P12)UC-MSCs部分细胞开始脱壁凋亡。对分离培养的UC-MSCs进行流式细胞术检测，干细胞表面标志物CD44、CD105、 CD29表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞为较纯化的UC-MSCs。 2经荧光显微镜下观察经PKH26染料标记的干细胞呈现红色荧光，通过计算标记率达到98%。倒置相差显微镜下观察，标记后细胞形态仍然成长梭形。 3UC-MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：当胎牛血清浓度为10%时MTT比色法检测的OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量多。当种植密度为105/ml时MTT比色法检测的OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量多。从绘制的细胞生长曲线来看，接种后的UC-MSCs生长状况包含三期，滞留期、生长对数期、平台期。 4汗腺细胞(h-SGCs)的培养：培养7天后，已有汗腺贴壁，镜下可见少量汗腺团块周围爬出不规则形细胞，呈集落状生长；10天后，镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞，呈铺路石样生长。 5经荧光显微镜下观察经CFDA SE细胞标记液标记的汗腺细胞呈现绿色荧光，通过计算标记率达到99%。 6干细胞/汗腺细胞融合细胞鉴定：将干细胞/汗腺细胞融细胞进行免疫组化检测细胞特异抗原，CEA和CK19包浆染色为棕色，为阳性。将干细胞/汗腺细胞融合体进行流式细胞术检测，表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达。 结论： 本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离后，在不同条件下培养、诱导及鉴定，得出人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过细胞融合技术获得干细胞/汗腺细胞融合细胞，检测融合细胞表面标记物的表达率和表面抗原的表达情况，得到以下结论： 1流式细胞术检测培养细胞的表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞较纯，可以用于实验研究。 2PKH26染料可以作为活体示踪染料，在荧光显微镜下呈现红色荧光，染色较均匀，且不影响细胞的正常传代。 3在实验中我们发现UC-MSCs最适宜的生长环境为：培养液中胎牛血清和DMEM(L)培养基的配比是1:9，最适宜的种植密度是105/ml。UC-MSCs生长曲线呈近似“S”型，从实验中我们发现P3以内的UC-MSCs形态稳定、适应性强、代谢旺盛。如果条件允许，最好使用三代内的干细胞做实验。 4CFDA SE进入细胞后分解成CFSE可以作为活体示踪染料，在荧光显微镜下呈现绿色荧光，染色较均匀，且不影响细胞的正常传代。 5经鉴定诱导融合后的干细胞/汗腺细胞融细胞，免疫组化检测CEA和CK19表面抗原均为阳性，流式细胞术检测表面标志物CD29、CD44、CD105表达率较高，造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45几乎不表达。提示诱导融合后的干细胞/汗腺细胞融合体同时具备部分干细胞和汗腺细胞的生物学特性。
【关键词】：人脐带间充质干细胞(UC-MSCs) 人汗腺细胞(h-SGCs) 融合细胞 聚乙二醇化学融合法 荧光显微镜
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13
• 材料与方法13-22
• 结果22-24
• 附图24-33
• 附表33-34
• 讨论34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-40
• 综述 细胞融合技术实现汗腺再生的研究现状40-47
• 参考文献44-47
• 致谢47-48
• 个人简历48

【参考文献】

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本文编号：382728