MIPU1对阿霉素所致HEK293细胞凋亡的保护作用

发布时间：2017-05-23 08:02

  本文关键词：MIPU1对阿霉素所致HEK293细胞凋亡的保护作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：阿霉素(Doxorubicin, DOX)是临床上用于治疗肿瘤的化疗药物,但是阿霉素存在很大的毒副作用,如阿霉素心肌病,阿霉素肾病等。这些毒副作用主要和细胞凋亡有关。Mipu1是本科室发现的一个缺血预适应诱导表达上调的新基因(GenBank登录号为AY221750),并已证实Mipu1是一种KRAB型锌指蛋白,具有转录抑制作用。通过生物信息学比对,发现Mipu1结构上十分保守,在啮类动物和人之间具有相当高的同源性。同时发现凋亡相关基因Bax、Bcl-2、P53、Bid、Bak等的启动子区含有Mipu1的核心结合位点。然而,Mipu1是否可以在转录水平调节上述凋亡相关基因表达,从而减轻DOX的细胞毒性作用并不清楚。因此,本研究拟在探讨MIPU1对DOX所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制,以期为深入阐明新基因Mipu1的生物学功能提供新的证据,为预防DOX抗肿瘤治疗过程中的毒副作用提供新的思路。 方法：本次实验以DOX诱导人胚胎肾细胞(HEK293)凋亡为模型,通过瞬时转染MIPU1真核表达质粒pEGFP-MIPU1,使细胞过表达MIPU1。实验分为四组,即pEGFP组、MIPU1组、pEGFP+DOX组和MIPU1+DOX组。(1)采用MTT实验观察DOX处理下MIPU1过表达对细胞存活率的影响；(2)采用Hoechst33258染色、Caspase-3活性检测和流式细胞术分析MIPU1过表达对DOX所致细胞凋亡的影响；(3)采用Western blot和RT-PCR分析MIPU1过表达对DOX所致抗凋亡基因Bcl-2.促凋亡基因P53和Bax在蛋白和mRNA水平表达变化的影响；(5)采用双荧光素酶报告基因分析MIPU1对Bax启动子活性的影响。 结果：(1)HEK293细胞经过DOX处理后细胞存活率明显下降(p0.01VS pEGFP);当转染pEGFP-MIPU1使细胞过表达MIPU1后,DOX所致的细胞死亡被明显抑制(P0.05VS pEGFP+DOX)。(2)HEK293细胞经过DOX处理后细胞凋亡率明显增加(P0.01VSpEGFP)；过表达MIPU1则明显抑制DOX所致的细胞凋亡率的增加(P0.01VS pEGFP+DOX)=(3)DOX处理HEK293细胞后,Bcl-2的表达明显减少(P0.05VS pEGFP);但是过表达MIPU1后Bcl-2的表达则明显增多(P0.05VS pEGFP+DOX)。(4) HEK293细胞经过DOX处理后,Bax和P53的表达明显增多(P0.05VSpEGFP);过表达MIPU1后,Bax和P53的表达则明显下降(P0.05VS pEGFP+DOX)。(5)将含有Bax启动子的报告基因与pEGFP-MIPU1共同转染细胞后,发现荧光素酶活性明显下降,且两者呈量效关系,当Bax启动子发生突变后,则荧光素酶活性不受影响(P0.01VS pEGFP)。 结论：(1)MIPU1过表达对DOX引起的HEK293细胞凋亡具有保护作用；(2)其机制可能与抑制DOX导致的Bcl-2的减少、P53和Bax的增多有关；(3)MIPU1能抑制Bax基因启动子的转录活性,其抑制作用可能依赖于MIPU1的特异性结合位点。图23幅,参考文献45篇。
【关键词】：HEK293 阿霉素 细胞凋亡 MIPU1 Bax P53 Bcl-2
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-11
• 符号说明11-12
• 1 绪论12-16
• 2 材料与方法16-24
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 主要材料和试剂16
• 2.1.2 主要实验仪器16-17
• 2.1.3 引物序列17
• 2.2 方法17-23
• 2.2.1 HEK293细胞的培养及处理17
• 2.2.2 转化17-18
• 2.2.3 质粒的提取18
• 2.2.4 pEGFP-MIPU1真核表达质粒酶切鉴定18
• 2.2.5 pEGFP-MIPU1质粒测序18-19
• 2.2.6 脂质体介导的瞬时转染19
• 2.2.7 细胞总RNA提取19
• 2.2.8 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)步骤19-20
• 2.2.9 BCA蛋白定量20-21
• 2.2.10 细胞总蛋白的提取和蛋白质免疫印迹分析21
• 2.2.11 Hoechst33258染核,检测细胞核凋亡形态及凋亡百分率计算21
• 2.2.12 MTT检测细胞存活率21-22
• 2.2.13 流式细胞数检测细胞凋亡22
• 2.2.14 Caspase-3活性检测22-23
• 2.2.15 双荧光素酶报告基因检测23
• 2.3 结果分析23-24
• 3 实验结果24-45
• 3.1 DOX对HEK293细胞中MIPU1表达的影响24-25
• 3.2 检测MIPU1的转染效率25-28
• 3.2.1 MIPU1真核表达质粒的酶切鉴定25
• 3.2.2 质粒测序结果25-26
• 3.2.3 MIPU1的转染与表达26-28
• 3.3 MIPU1对DOX所致细胞存活率的影响28-30
• 3.3.1 MTT检测不同浓度DOX处理HEK293细胞24h对细胞活性的影响28-29
• 3.3.2 MTT检测过表达MIPU1对细胞存活率的影响29-30
• 3.4 MIPU1过表达对DOX所致细胞凋亡的影响30-34
• 3.4.1 Hoechst33258染核观察过表达MIPU1后细胞凋亡的变化情况30-31
• 3.4.2 流式细胞术检测1μDOX处理后的细胞凋亡率31-32
• 3.4.3 流式细胞术检测MIPU1过表达对细胞凋亡率的影响32-34
• 3.4.4 检测MIPU1过表达对Caspase-3活性的影响34
• 3.5 MIPU1过表达对DOX所致Bcl-2表达的影响34-37
• 3.5.1 不同浓度DOX处理HEK293细胞24小时后Bcl-2蛋白的表达变化34-35
• 3.5.2 1μMDOX处理HEK293细胞不同时间点后Bcl-2蛋白的表达变化35-36
• 3.5.3 过表达MIPU1对DOX所致Bcl-2在mRNA水平上的变化36
• 3.5.4 MIPU1过表达在蛋白水平上对Bcl-2的表达变化36-37
• 3.6 过表达MIPU1对P53表达的影响37-40
• 3.6.1 浓度DOX处理后p53在蛋白水平上的变化37-38
• 3.6.2 观察在DOX刺激下P53在mRNA水平上的变化38
• 3.6.3 MIPU1过表达后对DOX所致P53的mRNA表达的影响38-39
• 3.6.4 MIPU1过表达对DOX所致p53蛋白表达水平的影响39-40
• 3.7 MIPU1过表达对Bax表达的影响40-45
• 3.7.1 不同浓度DOX处理HEK293细胞24小时后Bax蛋白的表达变化40
• 3.7.2 1μgM DOX处理HEK293细胞不同时间点后Bax蛋白的表达变化40-41
• 3.7.3 MIPUl过表达对DOX所致Bax在mRNA水平上表达的变化41-42
• 3.7.4 Western blot检测MIPU1过表达对DOX所致Bax在蛋白水平上的表达变化42-43
• 3.7.5 双荧光素酶报告基因检测MIPU1对Bax基因是否存在转录调控作用43-45
• 4 分析与讨论45-48
• 5 结论48-49
• 参考文献49-53
• 综述53-64
• 参考文献59-64
• 附录64-69
• 攻读学位期间主要研究成果69-70
• 致谢70-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 高敏;王浩;刘瑛;涂自智;刘梅冬;陈广文;刘可;;Mipu1基因在内毒素血症小鼠组织中的表达研究[J];生命科学研究;2010年04期

2 屈顺林;郭芳;范文静;张弛;詹向阳;姜志胜;;心肌细胞缺氧复氧损伤时Mipu1启动子活性、Mipu1 mRNA表达变化及意义[J];山东医药;2012年23期

3 孙良忠,岳智慧,汤洁如,陈述枚,许韩师,陶瑜,关伟明;细胞凋亡在阿霉素肾病大鼠肾小球硬化过程中的意义[J];中华儿科杂志;2000年05期

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本文编号：387273