N-糖基化修饰对人源化IgG抗体药物生产细胞株筛选的重要性
本文关键词：N-糖基化修饰对人源化IgG抗体药物生产细胞株筛选的重要性，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：单克隆抗体生产细胞株的选择和优化对于抗体的生产的成本控制、时间安排至关重要。生产细胞株的筛选可以从两个方面来评估,一个方面是抗体表达量,另一个方面是抗体质量。抗体的表达量可通过Protein A定量检测,较方便快捷。而抗体的质量则表现在多个方面,如抗体的活性、体内半衰期、人体免疫原性等。这些方面的评估手段周期长,且需要大量的样品做鉴定。研究显示抗体IgG的Fc区域N-糖基化修饰是抗体在体内行驶其功能的决定性因素之一。因此若将N-糖链结构检测作为细胞株筛选评价的一项指标,则可降低抗体药物研发后期由于活性不理想而造成的损失。在单克隆抗体生产细胞株的初期筛选过程中,细胞的IgG表达量、活力、细胞密度、是否耗酸为细胞株评价的重要参数。本文中,一共涉及两种抗体的12个表达细胞株。这两种抗体均以CHO-K1细胞为宿主,使用谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)缺陷型基因扩增系统。细胞株的筛选从细胞转染开始,我们首先通过ELISA的方法筛选出一批稳定表达的细胞株,对这些细胞株再进行悬浮培养驯化,最终根据表达量、活力、细胞密度这三个方面筛选出了两种抗体表达各6个细胞株,分别是AB001-1-6以及AB002-1～6。对人源化抗体IgG药物生产细胞株筛选的参数进行了分析和评价,并且发现N-糖基化修饰的评价是细胞筛选后期必不可少的一个指标。12个细胞株筛选出后,对其进行葡萄糖补糖批培养,使其糖含量保持在3g/L以上。从细胞密度、活力、产酸代谢、细胞葡萄糖消耗以及表达量这5个方面分析细胞株的优良。结果表明,这12个细胞株在摇瓶内的表现为培养7天内细胞的活力均在90%以上,且细胞均为耗酸型细胞,这两个特点均利于细胞的大规模培养。7天培养结束时,收集上清液,使用Protein A、阳离子柱、阴离子柱三个步骤纯化IgG。HPLC-SEC方法检测发现,这12个样品纯度均超过99%,保证了它们的N-糖基化修饰检测不受杂质干扰。IgG抗体’Fc片段的N-糖链结构主要为核心岩藻糖修饰的复杂型糖链结构,糖链末端含有0、1、2个半乳糖修饰(GO,G1,G2),唾液酸修饰极少。使用超高效液相方法N_糖基化分析的结果显示这12个细胞株中有11个细胞株的糖基化修饰类似,主要为核,心岩藻糖修饰的复杂型糖链。糖基化修饰比例最高的为G0F,抗体AB001的GOF修饰比例为44.40+4.18%,而抗体AB002的GOF修饰比例为48.83±7.46%；其次是GIF, AB001抗体的修饰比例为30.60+4.56%,AB002抗体的修饰比例为24.78±8.13%；Man5的修饰比例,AB001为5.10±3.11%,AB002AB002的为4.71±0.85%。这些糖型修饰的比例,与己知相同类型的IgG抗体的N-糖链比例类似。AB002的糖基化修饰中有一组数据与其他11个抗体的数据均差异较大,其GOF修饰比例为18.01%,GIF为8.97%,而Man5的修饰比例为25.74%,Man6为13.11%,明显异常于正常细胞株。寡聚甘露糖的修饰曾被认为会导致IgG在体内的半衰期大大缩短,但近期有报道称相似比例甘露糖修饰的不同抗体,在体内的半衰期差别很大。CHO细胞糖基化通路中,对甘露糖修饰影响较大的有两个酶,一个为甘露糖苷酶(mannosidase),另一个为N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(N-acetyl glucosaminyl transferase Ⅰ, GnTI),通过这两个酶的RNA水平的检测,也许能发现该抗体高甘露糖修饰的原因所在。该抗体也可用于检验糖基化通路基因改造的效果。因此该高甘露糖修饰比例的抗体具有进一步研究的价值。两种抗体12个细胞株其N-糖基化修饰的差异说明在相同条件下,使用相同方法筛选出的细胞株,其表达IgG的Fc-N-糖基化修饰可能会存在较大的差异。细胞株筛选出后会对其进行进一步的优化,比如培养基、补料、扩大规模驯化等,这些均需要投入大量的人力和资源。在细胞株发展的早期,即将抗体N-糖基化修饰的检测引入作为检测细胞筛选的一项指标,放避免过多的人力、资源及时间的浪费。造成N-糖链修饰差异的因素很多,包括细胞株之间的差异,培养基的成分,培养条件及培养方式等。在筛选到较理想N-糖型修饰IgG表达细胞株的情况下,kG糖型修饰还可以通过基因改造方式进行进一步优化。因此N-糖基化修饰的检测更突显出了其存在的必要性。
【关键词】：人源IgG 抗体药物 N-糖基化修饰 细胞株筛选
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：
- 前言8-9
- 中文摘要9-11
- Abstract11-14
- 缩略词14-15
- 第一章 文献综述15-24
- 1.1 单克隆抗体药物概述15-16
- 1.2 单克隆抗体结构及生物学功能16-17
- 1.3 抗体药物生物功能17-18
- 1.4 单克隆抗体糖基化修饰结构及功能18-22
- 1.5 影响糖链修饰的因素以及改善糖链修饰的方法22-24
- 第二章 高表达细胞株的筛选及生长特征分析24-31
- 2.1 引言24-25
- 2.2 实验材料25-26
- 2.2.1 细胞株25
- 2.2.2 主要试剂和溶液25-26
- 2.3 实验方法26-27
- 2.3.1 细胞株构建方法(该部分内容具体数据未予显示)26
- 2.3.2 细胞补糖批培养及上清液收集26-27
- 2.4. 实验结果27-30
- 2.4.1 抗体AB001及AB002表达细胞株的初步筛选及筛选出细胞株的生长代谢特征27-30
- 2.5 讨论30-31
- 第三章 细胞表达产物的N-糖基化修饰分析31-39
- 3.1 实验材料31-32
- 3.2 实验方法32-33
- 3.2.1 细胞表达IgG纯化32
- 3.2.2 HPLC-SEC分析纯化所得IgG纯度32
- 3.2.3 N-linked糖基化分析32-33
- 3.3 实验结果33-37
- 3.3.1 HPLC-SEC鉴定各个细胞株纯化所得样品的纯度析33
- 3.3.2 细胞株与细胞株之间的N-糖基化修饰会存在较大差异33-37
- 3.4. 讨论37-39
- 全文总结39-40
- 致谢40-41
- 附录：已发表文章41-42
- 参考文献42-44
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