人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

发布时间：2017-05-23 22:14

  本文关键词：人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 建立人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)体外分离、培养及扩增的方法,观察MSCs体外培养增殖的生物学特性,并应用流式细胞术,检测细胞表型,分析鉴定MSCs的纯度。 方法： 本论文采用的主要研究方法如下： (1)无菌条件下抽取骨髓液5mL,用等体积PBS稀释混匀,室温下1500rpm离心10分钟,弃去脂肪层,将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液(1.077g/mL)上面,室温2500rpm离心30分钟,吸取界面白膜状层的单个核细胞。用PBS混悬后,室温1500rpm离心10分钟,弃上清并重复洗涤2次。用含10%FBS的LG—DMEM培养液重悬细胞,调整细胞密度为2x105/mL,接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。3天后首次换液,弃去悬浮细胞后,每2-3天换液一次。每日镜下观察细胞形态及生长变化,待细胞生长达80%-90%融合时,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA (1:1, V/V)进行消化,再按1：2比例进行传代培养,共传代三次。 (2) MSCs的生长曲线测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于24孔培养板培养,每天取3孔,计算平均值,连续培养8天,采用血球计数板计数法,绘制生长曲线。 (3)贴壁率测定：取P3细胞,按5×104/mL浓度接种于25cm2培养瓶内培养,每2小时取2瓶,消化计数,计算贴壁率,绘制贴壁率曲线。 (4) MSCs的表型鉴定：取P3细胞,将细胞消化吹打制成单细胞悬液,1500rpm离心5分钟,弃去上清液,用PBS重复洗涤后,调整细胞浓度为5×106/mL,各取细胞悬液100μL,分别滴加荧光标记抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、 HLA-DR-PE抗体10μL,4℃避光孵育30分钟,PBS洗涤后应用流式细胞仪进行检测,确定MSCs的表面标志物的表达情况。 结果： (1) MSCs属于骨髓中的单个核细胞,采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合可以有效分离、纯化人骨髓MSCs。细胞形态观察：细胞初接种入培养瓶时为圆形的单个核细胞,大小不一,与周围的血细胞相互混杂。培养24小时后,细胞开始出现贴壁,48-72小时细胞贴壁逐渐增多,72小时首次换液后,可见少量分散的短梭形及不规则多角形的初始贴壁细胞。第4-8天细胞生长快,呈集落样生长,可见有粗大的突起伸出,细胞形态呈梭形。第10-12天后细胞克隆进一步扩大,呈大的长梭形,培养至第14-16天时贴壁细胞可达80%～90%融合,大量贴壁细胞呈长梭状成纤维细胞样形态并列或呈漩涡状排列。传代细胞刚接种时为圆形,较大,24小时内能完全贴壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天细胞融合可达90%。细胞形态均匀,与成纤维细胞形态相似,大部分呈长梭状,排列规则。 (2) MSCs的生长曲线分析：细胞生长曲线呈S形,原代细胞生长比传代细胞慢。原代细胞接种后第0-3天为生长潜伏期；第4-12天为对数生长期；此后逐渐减缓,进入平台期。传代细胞培养时第1-2天细胞生长处于潜伏期,第3天开始细胞生长较快,至第6-7天达顶点,后进入平台期。 (3)测定贴壁率：传代后的细胞贴壁较快,4小时贴壁细胞超过50%,而12小时左右超过90%的细胞已经贴壁。 (4)流式细胞仪检测P3细胞显示：CD29、CD44、CD105的阳性表达率分别为99.82%、99.82%、97.38%,对CD34、HLA-DR的阳性表达率分别为4.94%、1.87%。 结论： (1)联合采用密度梯度离心法和贴壁培养法,能获得较高纯度和活性的MSCs,是一种简便可行的方法； (2)通过观察MSCs的细胞形态、生长特征以及细胞表型的表达情况,可对MSCs进行初步鉴定。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 分离 培养 鉴定
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 符号说明9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其移植治疗心肌梗死的研究进展12-21
• 2.1 概述12-13
• 2.2 间充质干细胞的发展历史13
• 2.3 间充质干细胞的生物学特性13-16
• 2.3.1 MSCs的来源与分布13-14
• 2.3.2 MSCs的体外分离、纯化14
• 2.3.3 MSCs的体外培养14-15
• 2.3.4 MSCs的细胞学特性15-16
• 2.3.5 MSCs的多向分化潜能16
• 2.4 骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展16-20
• 2.4.1 基础研究16-17
• 2.4.2 临床研究17-18
• 2.4.3 MSCs移植治疗心肌梗死的机制18
• 2.4.4 MSCs移植治疗心肌梗死的移植时机与途径18-20
• 2.4.5 安全性评价20
• 2.5 结语20-21
• 第三章 实验部分21-38
• 3.1 实验材料21-22
• 3.1.1 骨髓标本来源21
• 3.1.2 主要试剂21
• 3.1.3 仪器设备21-22
• 3.1.4 主要试剂配制22
• 3.2 实验方法22-25
• 3.2.1 MSCs的体外分离与培养22-23
• 3.2.1.1 骨髓采集22
• 3.2.1.2 分离与原代培养22-23
• 3.2.1.3 传代培养23
• 3.2.2 MSCs的冻存与复苏23-24
• 3.2.2.1 细胞冻存23-24
• 3.2.2.2 细胞复苏24
• 3.2.3 MSCs的鉴定24-25
• 3.2.3.1 形态学观察24
• 3.2.3.2 生长曲线的测定24-25
• 3.2.3.3 贴壁率的测定25
• 3.2.3.4 细胞表型鉴定25
• 3.3 实验结果25-32
• 3.3.1 骨髓MSCs的体外分离与培养25-26
• 3.3.1.1 分离及原代培养25-26
• 3.3.1.2 传代培养26
• 3.3.1.3 细胞冻存与复苏26
• 3.3.2 骨髓MSCs的鉴定26-32
• 3.3.2.1 形态学特征26-30
• 3.3.2.2 生长曲线分析30
• 3.3.2.3 贴壁率分析30-31
• 3.3.2.4 细胞表型鉴定31-32
• 3.4 讨论32-37
• 3.4.1 MSCs的体外分离与培养33-35
• 3.4.2 MSCs的表型与鉴定35-37
• 3.4.2.1 MSCs的表型35
• 3.4.2.2 MSCs的鉴定35-37
• 3.5 结论37-38
• 参考文献38-46
• 致谢46-47
• 攻读学位期间发表的学术论文目录47-48

【参考文献】

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1 顾翔;许厚田;李铭辉;段俊斐;顾健;陈勇;高松;张玲芳;徐日新;孙磊;刘晓东;谢勇;;外周血干细胞移植治疗老年心肌梗死后心力衰竭患者的疗效及安全性[J];中华老年多器官疾病杂志;2009年05期

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本文编号：389238