昆明市小儿腹泻相关病毒的分子流行病学研究及病毒基因组克隆

发布时间：2017-05-24 11:17

  本文关键词：昆明市小儿腹泻相关病毒的分子流行病学研究及病毒基因组克隆，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小儿腹泻疾病(pedo-diarrheal disease)是由多病原、多因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的消化道疾病,是导致全球5岁以下儿童死亡的第二大原因。其病因复杂,治疗较困难,易造成营养不良等疾病,严重影响婴幼儿的生长发育,甚至引起死亡,是发展中国家小儿死亡的主要原因之一,故WHO把腹泻病的控制列为全球性战略。病毒性腹泻是是小儿腹泻的主要类型,引起小儿腹泻的主要病原体有：人轮状病毒(human rotavirus, HRV)、人诺如病毒(human norovirus, HNV)人星状病毒(human astro virus, HAstV)、肠道病毒(entero virus, ET virus)、甲肝病毒(hepatovirus)等,其中最常见的是HRV. HNV和HAstV。本研究主要针对昆明市小儿腹泻有关病毒HRV、 HNV和HAstV进行分子流行病学研究；利用逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增得到部分HNV全基因组cDNA和全部HAstV全基因组序列；另外,以人结肠癌细胞(HT-29cell)为基质,对HT-29细胞分离培养HAstV的相关条件进行了初步探索。 (1)昆明地区HRV、 HNV和HAstV流行病学研究和病毒分型 根据基因库中HRV、 HNV和HAstV各病毒的核苷酸特异性高度保守区设计病毒鉴定引物和病毒分型引物。通过对RT-PCR检测体系及条件的摸索,建立起稳定的HRV、 HNV和HAstV三种病毒检测体系。对39份小儿腹泻粪便检测结果为：HRV13份、HNV12份和HAstV12份,占总量百分比分别为的33.33%、30.77%、30.77%。 通过RT-PCR和分型序列测序方法对病毒分型,HNV全为GⅡ型；HAstV全为HAstV-1型；HRV型别有：2例?P[6]、1例?P[9]、1例?P[10]、1例?P[8]、1例G2P[8]、4例G2P[4]、1例?P[4]和?P[8]混合感染样品、1例G2P[8]和G8P[8]混合感染样品,其中G2P[4]型所占比列最高33.3%,可能为昆明地区HRV的优势流行株。 (2)克隆HNV和HAstV病毒基因组cDNA 从NCBI GeneBank中下载各型别HNV和HAstV病毒全基因组,用DNAMAN软件比对后,根据比对结果设计病毒基因组扩增引物各6对。RT-PCR对HNV和HAstV基因组扩增结果为：3段HNV全基因组共计3.6kb；全长HAstV基因组6.8kb,上传至GENEBANK登录号为KC342249,并命名为KM-l。 HAstV全基因组核苷酸序列与同型别病毒株SH-1同源性为98.4%,印度株(G1)95.0%；与其它型别病毒同源性分别为：G282.9%,G381.9%,G476.2%,G582%,G666.2%, G884.5%。 KM-1全基因组氨基酸同源性比较,发现KM-1的ORFla, ORFlb编码的非结构蛋白前体和RNA依赖的RNA酶与其它型别的病毒株同源性较高,而KM-1ORF2编码的衣壳蛋白前体氨基酸与同型别病毒同源性较高,印度株为97.97%,上海株(SH-1)为98.35%；与不同型别的HAstV在该区段的同源性较低,在62.64%-75.79%之间。重组事件分析发现KM-1有3个序列区域发生重组,分别是1996-2229碱基区、3608-4155碱基区和3608-4155区域。1996-2229区域与俄罗斯株(GU732187)同源性最高：3608-4155区域与韩国株(JN887820)同源性较高,5937-5981区域可能来源于印度株(AF260508)。 (3) HAstV的培养 以初培养密度为40%-50%的HT-29细胞为基质,将病毒稀释液处理后的HAstV腹泻粪便上清1ml接种到HT-29细胞上,并加入胰蛋白酶致终浓度10ug/mL,用含2%小牛血清的维持液培养,第3、6d后分别收取细胞和上清,RT-PCR鉴定结果表明HAstV能够被HT-29细胞从粪便样品中分离出来。PEG或超滤法浓缩病毒后电镜镜检观察到HAstV,直径为40nm左右。 本实验较为详细的对2012-2013年昆明地区小儿腹泻有关病毒分子流行病学调查并准确地进行了病毒分型,以上数据连同扩增得到的HNV、 HAstV基因组以及HAstV的成功培养,为进一步研究HRV、 HNV、 HAstV打下了坚实的基础。
【关键词】：小儿腹泻 病毒 检测 分子流行病学 基因组 克隆 培养
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-12
• 插图和附表清单12-14
• 英文缩略语索引14-15
• 第一章 绪论15-28
• 1.1 小儿腹泻15-16
• 1.1.1 小儿腹泻临床症状15
• 1.1.2 小儿腹泻的起因15-16
• 1.2 轮状病毒16-18
• 1.2.1 HRV的结构特征16-17
• 1.2.2 HRV的流行情况17
• 1.2.3 HRV的基因分型17-18
• 1.3 诺如病毒18-20
• 1.3.1 HNV结构特征18-19
• 1.3.2 HNV流行病学19-20
• 1.3.3 HNV的基因分型20
• 1.4 星状病毒20-22
• 1.4.1 HAstV结构特征21
• 1.4.2 HAstV的流行情况21
• 1.4.3 HAstV基因分型21-22
• 1.5 HRV、HNV和HAsTV研究现状22-26
• 1.5.1 HRV、HNV和HAstV发病机理22-23
• 1.5.2 HRV、HNV和HAstV诊断检测技术23-24
• 1.5.3 HRV、HNV和HAstV预防及治疗24-26
• 1.6 本论文研究目的及意义26-28
• 第二章 小儿腹泻有关病毒分子流行病学分析28-56
• 2.1 材料和方法28-40
• 2.1.1 材料28-35
• 2.1.2 方法35-40
• 2.2 结果40-52
• 2.2.1 RT-PCR法检测小儿腹泻有关病毒40-48
• 2.2.2 HNV、HAstV基因型分析48-49
• 2.2.3 昆明市小儿腹泻有关病毒流行病学统计49-52
• 2.3 讨论52-55
• 2.3.1 RT-PCR检测体系的评价52-53
• 2.3.2 昆明市小儿腹泻有关病毒流行病学统计53-54
• 2.3.3 昆明市小儿腹泻有关病毒基因型54-55
• 2.4 小结55-56
• 第三章 病毒基因组的克隆56-79
• 3.1 材料和方法56-62
• 3.1.1 材料56-58
• 3.1.2 方法58-62
• 3.2 结果62-75
• 3.2.1 HNV、HAstV基因组的克隆62-63
• 3.2.2 HNV、HAstV基因组测序63-75
• 3.3 讨论75-78
• 3.3.1 病毒基因组引物设计75
• 3.3.2 RT-PCR扩增病毒基因组全序列对粪便样品量的要求75
• 3.3.3 HAstV全基因组序列测定与系统进化树分析75-76
• 3.3.4 HAstV全基因组核苷酸同源性比较及各个区编码的氨基酸序列同源性比较76-77
• 3.3.5 HAstV全基因组序列重组事件分析77-78
• 3.4 小结78-79
• 第四章 星状病毒的培养79-91
• 4.1 材料和方法79-84
• 4.1.1 材料79-82
• 4.1.2 方法82-84
• 4.2 结果84-87
• 4.2.1 HT-29细胞的培养84
• 4.2.2 HT-29细胞种毒星状病毒84-85
• 4.2.3 RT-PCR检测种毒结果85-86
• 4.2.4 电镜观察结果86-87
• 4.3 讨论87-90
• 4.3.1 星状病毒的细胞培养87-89
• 4.3.2 Caco-2细胞与HT-29细胞的比较89
• 4.3.3 HT-29细胞培养HAstV89
• 4.3.4 影响种毒的关键因素89-90
• 4.4 小结90-91
• 第五章 全文总结91-92
• 第六章 展望92-93
• 致谢93-94
• 参考文献94-100
• 附录A 攻读硕士期间发表论文及参与项目目录100

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：390619