麻疹病毒N蛋白的原核表达、纯化及胶体金免疫层析法的初步应用

发布时间：2017-05-24 13:02

  本文关键词：麻疹病毒N蛋白的原核表达、纯化及胶体金免疫层析法的初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：麻疼是一种有高度传染性的呼吸道疾病，我国自上世纪60年代初应用减毒活疫苗后发病率显著下降，但每年仍有散发患者在一定范围内流行，甚至引起死亡。因此，提高和改进麻疼快速诊断技术及时掌握麻疼疫情对该病的防控尤为重要。 核蛋白（Nudeocapsid N)是麻疼病毒颗粒中含量最多的蛋白，是病毒在繁殖和转录过程中第一个被合成的蛋白，具有较强的抗原活性，，是麻疼病毒的主要抗原之一。本实验根据NCBI上公布的麻疼病毒N蛋白基因序列，利用premer5.0设计引物。从含有麻疼抗原全基因序列的质粒中，通过PCR扩增获得目的基因片段，与载体pET-32a(+)分别进行BamH I与;I双酶切，T4DNA连接，再将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE)3,培养过夜后挑取单菌落，在培养物中加入IPTG诱导剂进行诱导表达，表达产物用SDS-PAGE电泳检测，并对表达菌基因组测序，最终成功构建重组质粒，命名为pET-32a (+)/N。之后对诱导表达条件进行优化，确定N蛋白最佳的诱导表达条件为：培养温度37°C, IPTG浓度0.20mmol/L,诱导时间4h。目的蛋白含（H S)标签，便于镍离子亲和层析纯化，结果显示蛋白纯度可达90%。 将表达的N蛋白应用于免疫层析胶体金检测试纸条的研制，采用梓檬酸三} 还原法，制备出三种不同粒径的胶体金溶液，通过实验蹄选出颗粒直径均一（24nm性质稳定的胶体金，用它标记麻疼病毒N抗原（标记量26i^g/mL)制备免疫胶体金，用纯化后的N蛋白（1.25mg/mL)和N蛋白多抗（1.0mg/mL)包被于5肖酸纤维素膜（NC)分别作为检测线（T线）和质控线（C线），组装试纸条，进行特异性、灵敏性、重复性和稳定性的验证。实验结果表明，该试纸条具有较好的重复性和稳定性，初步达到了检测麻疼病毒N抗体的要求。
【关键词】：麻疼病毒 N蛋白 表达纯化 胶体金
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.11
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符号与缩略语10-11
• 第一章 结论11-21
• 1.1 麻疹概述11-18
• 1.1.1 麻疹病毒的形态结构11-12
• 1.1.2 麻疹病毒的生物学特性12
• 1.1.3 麻疹病毒的基因结构及核蛋白(N)的结构特点12-13
• 1.1.4 麻疹病毒的变异性及其危害13-14
• 1.1.5 麻疹病毒的检测方法及其研究进展14-18
• 1.2 免疫胶体金快速检测技术的研究进展18-19
• 1.3 本研究的目的和意义19-21
• 第二章 麻疹病毒N蛋白基因的克隆及其表达与纯化21-43
• 2.1 材料和试剂21-31
• 2.1.1 菌种和载体21-22
• 2.1.2 引物22
• 2.1.3 主要仪器与设备22-23
• 2.1.4 主要试剂23-24
• 2.1.5 主要试剂的配制24-31
• 2.2 方法31-39
• 2.2.1 N蛋白基因的克隆31-33
• 2.2.2 目的基因与表达载体连接33-34
• 2.2.3 重组菌的诱导表达34-36
• 2.2.4 测序鉴定和菌种保藏36
• 2.2.5 小样诱导表达条件的优化36-37
• 2.2.6 重组pET-32a(+)/N蛋白纯化及Westblot鉴定37-39
• 2.3 结果39-42
• 2.3.1 重组质粒构建39
• 2.3.2 重组菌pET-32a(+)/N的诱导表达39-40
• 2.3.3 表达菌种的测序40
• 2.3.4 重组pET-32a(+)/N诱导条件优化结果40-41
• 2.3.5 重组pET-32(+)/N蛋白的纯化及蛋白印迹鉴定41-42
• 2.4 讨论42-43
• 第三章 麻疹胶体金免疫层析试纸条的研制43-55
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 试剂及材料43
• 3.1.2 主要试剂及配制43-44
• 3.1.3 主要仪器设备44
• 3.2 方法44-48
• 3.2.1 胶体金的制备及其鉴定44-45
• 3.2.2 金标抗体的制备及质量鉴定45-46
• 3.2.3 试纸条的组装及检测结果判定46-47
• 3.2.4 试纸条特异性实验47
• 3.2.5 试纸条灵敏性实验47
• 3.2.6 试纸条稳定性实验47
• 3.2.7 试纸条重复性试验47-48
• 3.3 结果48-53
• 3.3.1 胶体金质量鉴定48-49
• 3.3.2 胶体金颗粒大小的选择49
• 3.3.3 免疫胶体金优化选择及鉴定49-50
• 3.3.4 检测线及质控线包被浓度的选择及结果鉴定50-51
• 3.3.5 试纸条特异性检测结果51-52
• 3.3.6 试纸条灵敏性实验结果52-53
• 3.3.7 试纸条稳定性实验结果53
• 3.3.8 试纸条重复性实验结果53
• 3.4 讨论53-55
• 第四章 结论与展望55-57
• 4.1 结论55
• 4.2 展望55-57
• 参考文献57-65
• 附录A65-67
• 致谢67-68
• 攻读学位期间发表的学术论文目录68-69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 郭兰英,万卷芳;金标免疫层析对弓形虫抗体的检测[J];上海免疫学杂志;2000年06期

2 江静,刘一兵,周棱,宋玉庆,郭伟正;甲基苯丙胺免疫层析测试条的研制[J];同位素;2004年02期

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本文编号：390841