基于IPaH 1基因液相芯片技术快速检测志贺氏菌的研究

发布时间：2017-05-25 02:01

  本文关键词：基于IPaH 1基因液相芯片技术快速检测志贺氏菌的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：志贺氏菌（Shigella）是人类细菌性痢疾最常见的致病菌，严重威胁人类健康。目前志贺氏菌检测方法包括常规传统检测方法（如分离培养、生化反应、血清学分型）、免疫学检测方法、分子生物检测方法。每种检测方法均存在一定的局限性。因此开发特异、快速的志贺氏菌检测方法在食品、药品检验、控制细菌性痢疾大规模流行等方面具有重要意义。 研究目的：以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因（IpaH）为靶基因建立液相芯片检测系统，检测模拟样品中志贺氏菌。 研究方法：根据志贺氏菌毒力基因相关信息和引物设计原则设计相应的高特异性引物，通过PCR法检测IPaH1基因在鲍氏志贺氏菌、野生志贺氏菌、大肠埃希氏菌、大肠杆菌（O157:H7）、肠炎沙门氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌的表达水平，并对PCR反应中退火温度、引物浓度等进行优化。根据扩增的IPaH1基因序列设计探针，将探针偶联到微球上构建液相芯片，使其可与生物素化的PCR产物特异性结合，优化液相芯片检测条件，验证其重复性、特异性、灵敏度，从而建立最佳的检测方法。最后通过模拟志贺氏菌环境样品进行验证，在Luminex系统上实现双重特异性检测。 结果：通过特异性检测，IPaH1基因在志贺氏菌中特异性表达，，而在大肠埃希氏菌、大肠杆菌（O157:H7）、肠炎沙门氏菌、阪崎、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌中不表达；PCR反应的最适退火温度为55.0℃~59.0℃，引物最适终浓度为0.1μM，可直接用于液相芯片的检测。液相芯片检测的最适条件是变性时间2min、杂交温度54℃、杂交时间25min、孵育时间25min。重复性、特异性和灵敏度验证实验结果显示，被测菌株的特异性达到100％，核酸灵敏度为10-6ng，菌株的灵敏度为7.8CFU/mL。模拟志贺氏菌环境样品验证实验结果显示，被测的10类22种样品中无论是阳性组还是干扰组，荧光信号强度均明显高于空白组。通过本研究中建立的液相芯片技术检测模拟样品的准确度为100％。
【关键词】：志贺氏菌 液相芯片 IPaH1基因 探针
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 绪论13-25
• 1.1 志贺氏菌研究背景13-15
• 1.2 食品中志贺氏菌检测方法研究现状15-20
• 1.2.1 常规检测方法15-16
• 1.2.2 免疫学检测方法16
• 1.2.3 分子生物学检测方法16-20
• 1.3 液相芯片技术的发展及应用20-24
• 1.3.1 液相芯片的工作原理21-22
• 1.3.2 液相芯片的技术性能22
• 1.3.3 液相芯片技术在临床诊断中的应用22-24
• 1.4 研究的主要内容24-25
• 第二章 志贺氏菌特异性表达检测及 PCR 条件的确定25-36
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 菌种及来源25-26
• 2.1.2 主要仪器26-27
• 2.1.3 主要试剂27
• 2.1.4 培养基27-28
• 2.2 实验方法28-31
• 2.2.1 菌株的培养28
• 2.2.2 细菌基因组 DNA 的提取28-29
• 2.2.3 DNA 浓度测定及定量29-30
• 2.2.4 特异性基因选择及引物设计30-31
• 2.2.5 PCR 扩增目的基因31
• 2.2.6 PCR 反应条件优化31
• 2.3 实验结果31-35
• 2.3.1 引物初步筛选31-32
• 2.3.2 IPaH 1 在几种肠道致病菌的表达32-33
• 2.3.3 PCR 反应条件优化33-35
• 2.4 小结35-36
• 第三章 基于 IPaH 1 基因的液相芯片检测志贺氏菌方法建立36-55
• 3.1 实验材料37-40
• 3.1.1 菌种及来源37-38
• 3.1.2 主要试剂及配制38-39
• 3.1.3 主要仪器39-40
• 3.2 实验方法40-45
• 3.2.1 引物与探针的设计合成40-41
• 3.2.2 微球与探针的偶联41-42
• 3.2.3 液相芯片的质控42-43
• 3.2.4 杂交与检测43
• 3.2.5 杂交条件的确定43-44
• 3.2.6 液相芯片重复性验证44
• 3.2.7 液相芯片特异性验证44
• 3.2.8 液相芯片灵敏度验证44-45
• 3.2.9 液相芯片检测模拟样本45
• 3.3 实验结果45-53
• 3.3.1 IPaH 1 液相芯片检测杂交条件的确定45-48
• 3.3.2 IPaH 1 液相芯片检测志贺氏菌的重复性48
• 3.3.3 IPaH 1 液相芯片检测志贺氏菌的特异性48-49
• 3.3.4 IPaH 1 液相芯片检测志贺氏菌的灵敏度49-52
• 3.3.5 IPaH 1 液相芯片检测模拟样品52-53
• 3.4 小结53-55
• 第四章 讨论55-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-65
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果65-66
• 致谢66

【参考文献】

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本文编号：392447