一株多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体的分离及其基因组序列解析

发布时间：2017-05-25 15:21

  本文关键词：一株多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体的分离及其基因组序列解析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着抗生素在临床上长期、广泛的使用，细菌耐药性的出现及日益严重化给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是一类革兰阴性、氧化酶阳性、过氧化酶阴性的需氧非发酵菌，广泛存在于自然界和人体中。它可引起医院获得性肺炎、血液感染、泌尿系统感染以及皮肤软组织感染等，是院内获得性感染常见的致病菌。特别是耐药鲍曼不动杆菌和超级细菌的出现，使得临床治疗变得更加困难，已严重威胁人类健康。而抗生素面对越来越严重的耐药细菌也显示出了其应用的局限性，因而寻找新的治疗方法十分必要。 噬菌体(Bacteriophage)是感染细菌的病毒，在自然界中广泛存在，是生物圈中数量最多的生命形式，其种群达1031以上。由于噬菌体能“吃”细菌，噬菌体在发现之初就被用于治疗感染性疾病，在临床耐药菌问题日益严峻的今天，人们在尝试利用噬菌体或其功能基因编码物进行感染性疾病治疗方面做了许多探索，并显示了广泛的应用前景。 本文以一株临床分离的多耐药鲍曼不动杆菌株(AB1)作为宿主菌，并从该医院下水道污水中分离到1株噬菌体，命名为Abp l。得到该噬菌体之后，首先对其生物学特性进行了研究；其次提取基因组送北京华大基因研究中心进行测序，完成补洞后对基因组形状鉴定；最后对基因组进行了生物信息分析，证实噬菌体Abp l属于短尾噬菌体科T7噬菌体属KMV亚群。研究内容及结果主要包括以下几个方面。 1．多耐药鲍曼不动杆菌的分离鉴定。鲍曼不动杆菌AB I是从西南医院烧伤科分离的一株细菌，，经过检验科的生化方法鉴定为鲍曼不动杆菌。为进一步证实，设计了一对鲍曼不动杆菌的16S rRNA基因的引物，通过PCRXJAB1进行扩增，得到一条1500bp左右的条带，送北京华大基因研究中心测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，结果表明与多株鲍曼不动杆菌16S rRNA基因序列相似程度达到99%,进而确定AB1为鲍曼不动杆菌。药敏实验结果表明，AB I是一株多耐药鲍曼不动杆菌，对氨基糖普类、碳青霉烯类、头抱菌素、四环素及喳诺酮类抗生素耐药，而对多勃菌素B敏感，其MIC值为0.236mg/L 2.以鲍曼不动杆菌AB I为宿主菌，从西南医院污水中分离到1株可以形成透明噬菌斑的噬菌体，命名为Abp l。电镜观察发现有一个正多面体的头部，直径约55nm,并且有一个尾巴，长约15nm o因此Abp l属于短尾噬菌体科。噬菌体Abp l感染其宿主菌鲍曼不动杆菌的最佳感染复数是0.001。一步生长曲线表明，Abp l感染宿主菌的潜伏期约为1Omin,爆发期约为40min,爆发量高达350. SDS-PAGE蛋白电泳发现，Abp l至少含有11个条带，表明它至少含有11个结构蛋白，其中38KD左右对应的条带含量最多，为噬菌体的主要衣壳结构蛋白。 3．提取并纯化噬菌体Abp l基因组DNA,送北京华大基因研究中心进行全基因组建库和测序，进一步补洞得到噬菌体的基因组，噬菌体Abp1基因组的一般情况如下：1)基因组全长为42,185bp, G+C含量为39.15%(其中A=31.48%, G=21.96%, T=29.37%,C=17.19%);2)未见编码tRNA的基因；3)Abp1全基因组编码54个基因，平均每个基因长722bp,即每1000bp编码了1.29个基因，92.5%的基因组序列被用来编码基因；4)酶切方法证实Abp l是一个线性基因组。 4. Abp1基因组生物信息分析。该基因组含有54个基因，BLASTp比对氨基酸序列显示有26个基因是已知的，而有28个是功能未知的。其中有10基因编码了噬菌体Abp1的结构蛋白，其分子量大小也与SDS-PAGE条带对应分子量大小对应。Abp l基因组编码了4个HNH核酸内切酶、DNA成熟酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切酶、DNA内切酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和dNMP激酶。 5．利用全基因组比对和RNA聚合酶进化树分析证实Abp l属于短尾噬菌体科T7噬菌体属的KMV亚群。 噬菌体Abpl的全基因组序列已经提交NCBI,其序列号为JX6587900 综上所述，通过本研究，分离到了一株多耐药鲍曼不动杆菌AB1的裂解性噬菌体Abp l，并研究了其基本生物学特性，进一步对基因组测序和生物信息分析。结果表明噬菌体Abp l属于短尾噬菌体科T7噬菌体属的KMV亚群。一方面增加了对鲍曼不动杆菌噬菌体的进一步认识，另一方面为后期噬菌体治疗奠定基础。
【关键词】：多耐药鲍曼不动杆菌 T7噬菌体 全基因组比对 进化分析 最佳感染复数 一步生长曲线
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略语表5-7
• Abstract7-9
• 摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 鲍曼不动杆菌噬菌体的分离与鉴定13-27
• 2.1 临床分离宿主菌为鲍曼不动杆菌的鉴定13-20
• 2.1.1 试剂与材料13-15
• 2.1.2 实验方法15-17
• 2.1.3 结果与讨论17-20
• 2.2 宿主菌AB1的噬菌体的分离20-27
• 2.2.1 试剂与材料20-22
• 2.2.2 实验方法22-27
• 2.2.3 结果与讨论27
• 第三章 噬菌体Abp1的生物学特性27-39
• 3.1 噬菌体Abp1最佳感染复数的测定27-30
• 3.1.1 试剂与材料27-28
• 3.1.2 实验方法28-29
• 3.1.3 结果与讨论29-30
• 3.2 噬菌体Abp1一步生长曲线的绘制30-34
• 3.2.1 试剂与材料30-31
• 3.2.2 实验方法31-32
• 3.2.3 结果与讨论32-34
• 3.3 噬菌体Abp1结构蛋白的分析34-39
• 3.3.1 试剂与材料35-37
• 3.3.2 实验方法37
• 3.3.3 结果与讨论37-39
• 第四章 噬菌体Abp1的基因组测序及形状鉴定39-48
• 4.1 噬菌体Abp1的全基因组测序39-44
• 4.1.1 试剂与材料39-41
• 4.1.2 实验方法41-42
• 4.1.3 结果与讨论42-44
• 4.2 噬菌体Abp1基因组线状环状鉴定44-48
• 4.2.1 试剂与材料44-46
• 4.2.2 实验方法46
• 4.2.3 结果与讨论46-48
• 第五章 噬菌体Abp1基因组的生物信息学分析及分类48-59
• 5.1 噬菌体基因组Abp1基本生物信息学分析48-55
• 5.1.1 分析方法48-49
• 5.1.2 结果与讨论49-55
• 5.2 Abp1的分类55-59
• 5.2.1 实验方法56-57
• 5.2.2 结果与讨论57-59
• 全文总结59-60
• 参考文献60-65
• 文献综述 噬菌体治疗的最新进展：不同给药途径对噬菌体治疗效果的影响65-72
• 参考文献70-72
• 附录172-75
• 附录275-77
• 附录377-79
• 攻读硕士期间发表的文章79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 刘洋;黄允宁;杨勇;徐远义;杨世杰;杜鹏;;术前腹腔注射沙培林治疗进展期胃癌的临床观察[J];癌症;2010年04期

2 汪复;朱德妹;胡付品;阮斐怡;倪语星;孙景勇;徐英春;张小江;胡云健;艾效曼;俞云松;杨青;孙自镛;简翠;贾蓓;黄文祥;卓超;苏丹虹;魏莲花;吴玲;张朝霞;季萍;王传清;薛建昌;张泓;李万华;;2008年中国CHINET细菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2009年05期

3 汪复;朱德妹;胡付品;阮斐怡;倪语星;孙景勇;徐英春;张小江;胡云健;艾效曼;俞云松;杨青;孙自镛;李丽;贾蓓;黄文祥;卓超;苏丹虹;魏莲花;吴玲;张朝霞;季萍;王传清;薛建昌;张泓;李万华;徐元宏;沈继录;单斌;杜艳;;2009年中国CHINET细菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2010年05期

4 胡付品;朱德妹;汪复;蒋晓飞;杨青;徐英春;张小江;孙自镛;陈中举;王传清;王爱敏;倪语星;孙景勇;俞云松;林洁;单斌;杜艳;徐元宏;沈继录;张泓;孔菁;卓超;苏丹虹;张朝霞;季萍;胡云建;艾效曼;黄文祥;贾蓓;魏莲花;吴玲;;2011年中国CHINET细菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2012年05期

  本文关键词：一株多耐药鲍曼不动杆菌噬菌体的分离及其基因组序列解析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：394160