硫化氢参与新生期结肠炎性刺激诱发成年大鼠内脏痛的分子机制研究

发布时间：2017-05-25 17:19

  本文关键词：硫化氢参与新生期结肠炎性刺激诱发成年大鼠内脏痛的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 （1）研究CBS调控电压门控型钠通道在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用； （2）研究去甲肾上腺素（NE）通过CBS调控辣椒素受体（TRPV1）在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用； 方法 1.对出生十天的新生期雄性大鼠在肛门处插入2cm注射0.2ml的0.5%的冰醋酸(AA)造成新生期结肠炎性刺激(NCI)从而诱导成年大鼠的结肠慢性痛过敏模型。运用腹壁撤回评分（AWR score）方法评测NCI大鼠的痛行为反应。 2.结肠管壁注射荧光素（DiI）来标记结肠特异性背根节（DRG）神经元，运用全细胞膜片钳方法研究NCI大鼠中肠相关DRG神经元电压依赖型钠通道的变化特性。 3.运用ELISA试剂盒检测NCI模型大鼠血清中去甲肾上腺素（NE）的水平。 4.运用Western Blotting方法检测NCI模型大鼠肠相关DRG神经元中CBS,钠通道蛋白和TRPV1受体蛋白表达情况。 结果 1. NCI明显增加大鼠对结肠扩张的过敏反应，六周时，AWR评分显著高于对照组，这种痛觉反应持续至少三周。在第十周和第十二周时，AWR评分恢复到正常水平。 2. NCI增加肠相关DRG神经元（T13-L2）电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平。而十周龄时NCI组和对照组的肠相关DRG神经元电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平均没有显著差异。同样地，我们检测了六周龄NCI组和对照组的非肠相关神经元(L4-5)DRG，发现电压门控型钠通道的电流密度和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平均没有显著差异免疫组化三标技术显示在DRG肠特异性神经元中CBS和NaV1.7或NaV1.8共表达。 3.与对照组相比，NCI组CBS的表达水平显著上调。CBS的拮抗剂AOAA翻转NCI引起的大鼠内脏痛觉反应，最优剂量10mg/kg的药效持续至少一个小时。并且，，AOAA翻转NCI引起的肠相关DRG神经元钠电流密度的增加和NaV1.7和NaV1.8的蛋白表达水平的增加。 4.在最佳剂量下，非选择性β肾上腺素受体拮抗剂，而不是α肾上腺素受体拮抗剂，明显翻转由HIS诱导的大鼠结肠痛过敏。进一步研究发现，阻断β2肾上腺素受体明显降低由应激导致的AWR高评分，而β1和β3肾上腺素受体拮抗剂对这种高评分没有明显作用。 5. NE参与内脏痛敏感的形成。与对照组相比，ELISA结果显示，NCI大鼠血清NE激素水平显著上调。但是，β2受体蛋白表达水平与对照组相比没有明显变化。而且，去甲肾上腺素能诱导大鼠内脏痛过敏反应。 6. TRPV1表达水平上调是由NE介导的。NCI大鼠肠相关DRG神经（T13-L2）中，TRPV1蛋白表达显著上调。给予正常大鼠NE，肠相关DRG神经元（T13-L2）中TRPV1的蛋白表达水平显著上调。给予NCI组大鼠非选择性肾上腺素受体β拮抗剂，显著降低TRPV1蛋白表达水平。用细胞培养的方法，NE孵育正常大鼠的DRG细胞，CBS表达水平显著上调。 7. CBS参与NCI-TRPV1痛觉信号通路的传递。给予正常大鼠NE，肠相关DRG神经元（T13-L2）中CBS的蛋白表达水平显著上调。给予NCI组大鼠非选择性肾上腺素受体β拮抗剂，显著降低CBS蛋白表达水平。给予NCI组大鼠CBS拮抗剂AOAA，显著降低TRPV1蛋白表达水平。 8.用细胞培养的方法，NE孵育正常大鼠的DRG细胞，CBS和TRPV1表达水平显著上调。 结论 NCI可能通过CBS介导的两条信号通路诱导大鼠内脏痛觉过敏。一条通路是，CBS通过介导电压门控型钠通道诱导内脏痛；另外一条是，NCI诱导产生的去甲肾上腺素可能激活了大鼠初级感觉神经元的β2受体，β2受体激活后通过CBS介导肠相关DRG神经元中TRPV1活性的增加诱导内脏痛。因此，本研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制，从而可能为慢性内脏痛的治疗提供更有效的方案。
【关键词】：肠易激综合症 内脏痛过敏 肾上腺素受体 H_2S TRPV1受体 电压门控性钠通道
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-9
• 目录9-12
• 第一章 引言12-14
• 第二章 材料与方法14-26
• 2.1 实验对象14
• 2.2 新生期结肠炎性刺激症（Neonatal Colonic Inflammation ，NCI）模型的建立14
• 2.3 腹壁撤回反射(Abdominal Withdrawal Reflex，AWR) 评分检测痛阈14-15
• 2.3.1 实验仪器14
• 2.3.2 实验方法14
• 2.3.3 给药方法14
• 2.3.4 实验用药14-15
• 2.4 Western Blotting 检测蛋白表达15-17
• 2.4.1 实验试剂15-16
• 2.4.2 实验仪器16
• 2.4.3 实验方法16-17
• 2.5 急性分离 DRG 神经元和全细胞膜片钳实验17-20
• 2.5.1 实验试剂17-18
• 2.5.2 实验仪器18
• 2.5.3 荧光染料 DiI 标记肠相关 DRG 神经元18
• 2.5.4 急性分离 DRG 神经元18-19
• 2.5.5 拉制玻璃微电极：19
• 2.5.6 全细胞膜片钳记录：19-20
• 2.6 ELISA 检测激素水平20-22
• 2.6.1 实验试剂20-21
• 2.6.2 实验仪器21
• 2.6.3 准备血清样本21
• 2.6.4 实验方法21-22
• 2.7 原代 DRG 细胞培养22-23
• 2.7.1 实验试剂22
• 2.7.2 实验仪器22
• 2.7.3 急性分离 DRG 神经元22-23
• 2.7.4 培养 DRG 神经元23
• 2.8 免疫组化23-26
• 2.8.1 实验试剂23
• 2.8.2 实验仪器23-24
• 2.8.3 实验方法24-26
• 第三章 实验结果26
• 第一部分 CBS 调控电压门控型钠通道在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用26-40
• 3.1 新生期结肠炎性刺激（Neonatal Colonic Inflammation ，NCI）诱导大鼠内脏痛过敏26-27
• 3.2 NCI 增加肠相关 DRG 神经元电压门控型钠通道的活性27-29
• 3.2.1 NCI 增加肠相关 DRG 神经元电压门控型钠通道的电流密度27-29
• 3.2.2 NCI 增加肠相关 DRG 神经元中 NaV1.7 和 NaV1.8 的蛋白表达水平29
• 3.3 十周龄大鼠肠相关 DRG 神经元电压门控型钠通道的活性未发生改变29-31
• 3.3.1 十周龄大鼠 T13-L2 和六周龄大鼠 L4-5 节段记录的钠电流29-30
• 3.3.2 十周龄大鼠 T13-L2 节段 NaV1.7 和 NaV1.8 的蛋白表达水平1930-31
• 3.4 NCI 模型中非肠相关 DRG（L4-5）神经元电压门控型钠通道的活性未发生改变31-33
• 3.4.1 六周龄大鼠 L4-5 节段记录的钠电流31-33
• 3.4.2 六周龄大鼠 L4-5 节段 NaV1.7 和 NaV1.8 的蛋白表达水平33
• 3.5 钠通道参与 NCI 诱导的成年大鼠内脏痛是由 CBS 介导的33-40
• 3.5.1 NCI 增加肠相关 DRG 神经元中 CBS 的蛋白表达水平33-34
• 3.5.2 AOAA 翻转 NCI 诱导的 NaV1.7 和 NaV1.8 的蛋白表达水平的增加34-35
• 3.5.3 AOAA 翻转 NCI 诱导的钠电流密度的增加35-37
• 3.5.4 CBS 和 NaV1.7、 NaV1.8 在肠相关 DRG 神经元中共表达。37-38
• 3.5.5 AOAA 翻转由 NCI 诱导的大鼠内脏痛过敏38-40
• 第二部分 去甲肾上腺素（NE）通过 CBS 调控辣椒素受体（TRPV1）在新生期结肠炎性刺激诱导的慢性内脏痛中的作用40-48
• 3.6 NCI 诱导的大鼠内脏痛过敏是由肾上腺素能受体β2介导的40-42
• 3.6.1 非选择性β肾上腺素受体拮抗剂 Propranolol 明显翻转 HIS 诱导的内脏痛过敏40-41
• 3.6.2 选择性β2肾上腺素受体拮抗剂 Butoxamine 翻转 HIS 诱导的内脏痛过敏41-42
• 3.7 NE 参与内脏痛敏感的形成42-44
• 3.7.1 NCI 增加大鼠血清中 NE 的浓度42-43
• 3.7.2 去甲肾上腺素能诱导大鼠内脏痛过敏反应43-44
• 3.8 TRPV1 表达水平和电流增加是由 NE 介导的44-46
• 3.8.1 NCI 增加 TRPV1 的蛋白表达水平和电流44-45
• 3.8.2 NE 介导 TRPV1 表达水平和电流增加45-46
• 3.9 CBS 参与 NCI- TRPV1 痛觉信号通路的传递46-47
• 4.0 在离体条件下，NE 增强 CBS 和 TRPV1 的蛋白表达47-48
• 第四章 讨论48-51
• 参考文献51-55
• 综述55-64
• 攻读硕士学位期间公开发表的论文、会议摘要和奖励64-65
• 致谢65-66

【共引文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 唐驱波;TNF-α、NGF、负性情绪在Ⅲ型前列腺炎中的作用及相关性研究[D];重庆医科大学;2010年

  本文关键词：硫化氢参与新生期结肠炎性刺激诱发成年大鼠内脏痛的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：394448