乙肝病毒X蛋白相关细胞因子的分离、鉴定及功能性研究
发布时间：2025-02-08 10:47
人乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝病毒属病毒,具有肝脏嗜性,可引起人肝脏急性、慢性感染,肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。流行病学资料和诸多研究结果证明HBV感染可能是HCC发生的首要诱因,这与肝细胞的生长、凋亡和再生的调控特点,HBV编码的X蛋白(HBx)的结构和功能特性有着密切的关系。HBx蛋白主要通过与细胞蛋白的相互作用来调控和激活宿主细胞和病毒基因的转录表达,影响细胞凋亡,抑制细胞中受损DNA的外切修复反应以及激活细胞中信号转导通路(如MAPK、JAK、STAT)的级联反应,以及调控病毒自身的复制与增殖等。到目前为止,已经发现的与HBx蛋白相互作用的细胞和其他病原蛋白有几十种,功能范围涉及到肝细胞的生长、调亡和再生过程中的信号转导及其调控,肝细胞的基因转录,DNA的修复及其调控,大分子在核与胞浆间穿梭等。目前还没有足够的证据阐明HBx蛋白在HCC的发生与发展中的确切分子机制。因此,分离鉴定新的与HBx相互作用的宿主或其它病原生物的蛋白因子、阐明其功能等,是揭示HBx...
【文章页数】：160 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 前言
1.1 HBV及其相关的疾病
1.1.1 HBV分子生物学及其研究进展
1.1.1.1 HBV基因组结构及其功能特点
1.1.1.2 HBV的复制和转录
1.1.1.3 HBV编码蛋白的结构及其功能
1.1.1.3.1 囊膜蛋白
1.1.1.3.2 病毒核心蛋白及e抗原
1.1.1.3.3 病毒的P蛋白
1.1.1.3.4 HBx蛋白
1.1.2 肝脏是嗜肝DNA病毒感染的靶器官
1.1.2.1 肝细胞生长和细胞凋亡相关的生长因子和细胞因子
1.1.2.2 肝细胞凋亡、增殖和再生相关的信号转导途径
1.2 HCC的分子病理学
1.2.1 HBV病毒基因在HCC形成过程中的作用
1.2.2 HBx在HCC形成过程中的作用
1.3 HBx蛋白及相关细胞蛋白的研究进展
1.3.1 HBx的表达与调控
1.3.2 HBx蛋白及其相互作用蛋白质
1.3.3 受HBx蛋白调控的基因或蛋白质
1.3.4 HBx蛋白参与调控的细胞信号转导途径
1.3.4.1 HBx激活蛋白激酶C
1.3.4.2 HBx上调NF-κB
1.3.4.3 HBx激活Ras-raf-MAPK信号盒
1.3.4.4 HBx激活应激激活蛋白激酶和Jun N-末端激酶途径
1.3.4.5 HBx激活蛋白激酶B(PKB/Akt)途径
1.3.4.6 HBx蛋白上调Janus激酶/STAT途径
1.3.5 HBx蛋白与肝细胞凋亡
1.4 本研究的目的和意义
第二章 HBV基因组的克隆及其遗传演化分析
2.1 材料与方法
2.1.1 血清
2.1.2 菌种、质粒
2.1.3 HBV基因组DNA的提取
2.1.4 HBV全基因组的扩增
2.1.5 PCR产物的回收
2.1.6 HBV基因组DNA的酶切鉴定
2.1.7 HBV全基因组与T载体的连接
2.1.8 连接产物的电转化
2.1.8.1 感受态细胞的制备
2.1.8.2 电转化
2.1.9 质粒的提取
2.1.10 重组质粒pGEM-HBV的酶切鉴定
2.1.11 HBV核苷酸序列测定
2.1.12 HBV的序列分析
2.2 结果
2.2.1 HBV全基因组PCR扩增
2.2.2 HBV基因组DNA的酶切鉴定
2.2.3 重组质粒pGEM-HBV的酶切鉴定
2.2.4 HBV全基因组核苷酸序列测定及其遗传演化分析
2.3 讨论
第三章 HBx基因相关载体的构建及其鉴定
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 HBx和HBs基因的扩增
3.1.3 HBx和HBs PCR产物纯化、连接及转化
3.1.4 重组质粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs酶切鉴定
3.1.5 重组质粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs核苷酸序列测定
3.1.6 HBx基因的核苷酸序列分析
3.2 结果
3.2.1 PCR扩增HBx和HBs基因
3.2.2 重组质粒的鉴定
3.2.3 重组质粒pGBKT7-HBx和pGBKT7-HBs核苷酸序列测定
3.2.4 HBx基因的核苷酸序列及其遗传演化分析
3.2.5 HBx蛋白基因表达载体的构建
3.3 讨论
第四章 HBx相互作用细胞蛋白基因的筛选
4.1 材料与方法
4.1.1 酵母双杂交系统预制文库
4.1.2 pGBKT7-x的酵母转化
4.1.2.1 酵母菌AH109的培养及其表型鉴定
4.1.2.2 酵母感受态细胞的制备
4.1.2.3 酵母的转化
4.1.3 阳性菌株表型鉴定
4.1.3.1 转化菌落的表型鉴定
4.1.3.2 HBx对酵母的毒性测试
4.1.3.3 HBx基因转录自激活测试
4.1.4 预制文库的筛选
4.1.4.1 HBx Bait酵母菌株的培养及其增菌
4.1.4.2 Mating试验
4.1.4.3 Mating试验中菌落转移及纯化
4.1.5 酵母菌质粒的提取
4.1.6 酵母菌质粒的转化
4.1.7 AD质粒的提取及鉴定
4.1.8 AD质粒和Bait质粒pGBKT7—HBx共转化
4.1.9 AD片段的序列测定
4.2 结果
4.2.1 酵母菌的表型鉴定
4.2.2 HBx蛋白对酵母的毒性测试
4.2.3 HBx基因转录自激活测试
4.2.4 Mating试验
4.2.5 阳性克隆的鉴定及其分析
4.2.5.1 阳性克隆的PCR鉴定
4.2.5.2 阳性克隆的PCR产物的酶切鉴定
4.2.5.3 阳性克隆AD质粒的提取及鉴定
4.2.6 阳性克隆的核苷酸序列测定及其序列分析
4.3 讨论
第五章 阳性克隆的体外体内鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 体外翻译
5.1.2.1 AD片段编码区体外翻译模板的扩增及其纯化
5.1.2.2 Bait蛋白HBx体外翻译
5.1.2.3 AD蛋白体外翻译
5.1.3 免疫沉淀及其检测
5.1.4 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫荧光共定位
5.1.4.1 相关基因表达载体的构建
5.1.4.2 细胞培养及转染
5.1.4.3 免疫荧光标记及其检测
5.1.5 体内免疫共沉淀试验
5.2 结果
5.2.1 AD片段编码区体外翻译模板的扩增
5.2.2 免疫沉淀及其检测
5.2.3 HBx蛋白和AD蛋白免疫共定位研究相关基因表达载体的构建
5.2.4 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫荧光共定位试验
5.2.5 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫共沉淀试验
5.3 讨论
第六章 HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用的细胞功能研究
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 细胞
6.1.3 临床组织样品总RNA的提取
6.1.4 Hepsin蛋白基因扩增
6.1.5 Hepsin蛋白基因克隆及其鉴定
6.1.6 Hepsin蛋白基因序列测定
6.1.7 细胞增殖活性测定
6.1.8 细胞凋亡诱导和细胞凋亡率的测定
6.1.9 DAPI染色分析
6.1.10 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对HBV蛋白表达及病毒复制影响
6.2 结果
6.2.1 Hepsin基因的扩增及其克隆
6.2.2 Hepsin基因核苷酸序列测定及其序列分析
6.2.3 Hepsin基因在临床样品中表达水平研究
6.2.4 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对细胞增殖能力的影响
6.2.5 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对细胞凋亡的影响
6.2.6 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对HBV蛋白表达及病毒复制影响
6.3 讨论
研究总结
参考文献
附录Ⅰ 论文涉及引物一览表
附录Ⅱ 论文涉及的试剂及其配制
附录Ⅲ 在读期间发表文章
致谢
本文编号：4031405
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【学位级别】：博士
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中文摘要
英文摘要
第一章 前言
1.1 HBV及其相关的疾病
1.1.1 HBV分子生物学及其研究进展
1.1.1.1 HBV基因组结构及其功能特点
1.1.1.2 HBV的复制和转录
1.1.1.3 HBV编码蛋白的结构及其功能
1.1.1.3.1 囊膜蛋白
1.1.1.3.2 病毒核心蛋白及e抗原
1.1.1.3.3 病毒的P蛋白
1.1.1.3.4 HBx蛋白
1.1.2 肝脏是嗜肝DNA病毒感染的靶器官
1.1.2.1 肝细胞生长和细胞凋亡相关的生长因子和细胞因子
1.1.2.2 肝细胞凋亡、增殖和再生相关的信号转导途径
1.2 HCC的分子病理学
1.2.1 HBV病毒基因在HCC形成过程中的作用
1.2.2 HBx在HCC形成过程中的作用
1.3 HBx蛋白及相关细胞蛋白的研究进展
1.3.1 HBx的表达与调控
1.3.2 HBx蛋白及其相互作用蛋白质
1.3.3 受HBx蛋白调控的基因或蛋白质
1.3.4 HBx蛋白参与调控的细胞信号转导途径
1.3.4.1 HBx激活蛋白激酶C
1.3.4.2 HBx上调NF-κB
1.3.4.3 HBx激活Ras-raf-MAPK信号盒
1.3.4.4 HBx激活应激激活蛋白激酶和Jun N-末端激酶途径
1.3.4.5 HBx激活蛋白激酶B(PKB/Akt)途径
1.3.4.6 HBx蛋白上调Janus激酶/STAT途径
1.3.5 HBx蛋白与肝细胞凋亡
1.4 本研究的目的和意义
第二章 HBV基因组的克隆及其遗传演化分析
2.1 材料与方法
2.1.1 血清
2.1.2 菌种、质粒
2.1.3 HBV基因组DNA的提取
2.1.4 HBV全基因组的扩增
2.1.5 PCR产物的回收
2.1.6 HBV基因组DNA的酶切鉴定
2.1.7 HBV全基因组与T载体的连接
2.1.8 连接产物的电转化
2.1.8.1 感受态细胞的制备
2.1.8.2 电转化
2.1.9 质粒的提取
2.1.10 重组质粒pGEM-HBV的酶切鉴定
2.1.11 HBV核苷酸序列测定
2.1.12 HBV的序列分析
2.2 结果
2.2.1 HBV全基因组PCR扩增
2.2.2 HBV基因组DNA的酶切鉴定
2.2.3 重组质粒pGEM-HBV的酶切鉴定
2.2.4 HBV全基因组核苷酸序列测定及其遗传演化分析
2.3 讨论
第三章 HBx基因相关载体的构建及其鉴定
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 HBx和HBs基因的扩增
3.1.3 HBx和HBs PCR产物纯化、连接及转化
3.1.4 重组质粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs酶切鉴定
3.1.5 重组质粒pGBKT7-x和pGBKT7-HBs核苷酸序列测定
3.1.6 HBx基因的核苷酸序列分析
3.2 结果
3.2.1 PCR扩增HBx和HBs基因
3.2.2 重组质粒的鉴定
3.2.3 重组质粒pGBKT7-HBx和pGBKT7-HBs核苷酸序列测定
3.2.4 HBx基因的核苷酸序列及其遗传演化分析
3.2.5 HBx蛋白基因表达载体的构建
3.3 讨论
第四章 HBx相互作用细胞蛋白基因的筛选
4.1 材料与方法
4.1.1 酵母双杂交系统预制文库
4.1.2 pGBKT7-x的酵母转化
4.1.2.1 酵母菌AH109的培养及其表型鉴定
4.1.2.2 酵母感受态细胞的制备
4.1.2.3 酵母的转化
4.1.3 阳性菌株表型鉴定
4.1.3.1 转化菌落的表型鉴定
4.1.3.2 HBx对酵母的毒性测试
4.1.3.3 HBx基因转录自激活测试
4.1.4 预制文库的筛选
4.1.4.1 HBx Bait酵母菌株的培养及其增菌
4.1.4.2 Mating试验
4.1.4.3 Mating试验中菌落转移及纯化
4.1.5 酵母菌质粒的提取
4.1.6 酵母菌质粒的转化
4.1.7 AD质粒的提取及鉴定
4.1.8 AD质粒和Bait质粒pGBKT7—HBx共转化
4.1.9 AD片段的序列测定
4.2 结果
4.2.1 酵母菌的表型鉴定
4.2.2 HBx蛋白对酵母的毒性测试
4.2.3 HBx基因转录自激活测试
4.2.4 Mating试验
4.2.5 阳性克隆的鉴定及其分析
4.2.5.1 阳性克隆的PCR鉴定
4.2.5.2 阳性克隆的PCR产物的酶切鉴定
4.2.5.3 阳性克隆AD质粒的提取及鉴定
4.2.6 阳性克隆的核苷酸序列测定及其序列分析
4.3 讨论
第五章 阳性克隆的体外体内鉴定
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 体外翻译
5.1.2.1 AD片段编码区体外翻译模板的扩增及其纯化
5.1.2.2 Bait蛋白HBx体外翻译
5.1.2.3 AD蛋白体外翻译
5.1.3 免疫沉淀及其检测
5.1.4 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫荧光共定位
5.1.4.1 相关基因表达载体的构建
5.1.4.2 细胞培养及转染
5.1.4.3 免疫荧光标记及其检测
5.1.5 体内免疫共沉淀试验
5.2 结果
5.2.1 AD片段编码区体外翻译模板的扩增
5.2.2 免疫沉淀及其检测
5.2.3 HBx蛋白和AD蛋白免疫共定位研究相关基因表达载体的构建
5.2.4 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫荧光共定位试验
5.2.5 HBx蛋白与其相互作用蛋白免疫共沉淀试验
5.3 讨论
第六章 HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用的细胞功能研究
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 细胞
6.1.3 临床组织样品总RNA的提取
6.1.4 Hepsin蛋白基因扩增
6.1.5 Hepsin蛋白基因克隆及其鉴定
6.1.6 Hepsin蛋白基因序列测定
6.1.7 细胞增殖活性测定
6.1.8 细胞凋亡诱导和细胞凋亡率的测定
6.1.9 DAPI染色分析
6.1.10 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对HBV蛋白表达及病毒复制影响
6.2 结果
6.2.1 Hepsin基因的扩增及其克隆
6.2.2 Hepsin基因核苷酸序列测定及其序列分析
6.2.3 Hepsin基因在临床样品中表达水平研究
6.2.4 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对细胞增殖能力的影响
6.2.5 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对细胞凋亡的影响
6.2.6 Hepsin蛋白与HBx蛋白相互作用对HBV蛋白表达及病毒复制影响
6.3 讨论
研究总结
参考文献
附录Ⅰ 论文涉及引物一览表
附录Ⅱ 论文涉及的试剂及其配制
附录Ⅲ 在读期间发表文章
致谢
本文编号：4031405
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