SPIO及LV-GFP对TSCs标记的有效性和安全性分析

发布时间：2017-06-01 10:15

  本文关键词：SPIO及LV-GFP对TSCs标记的有效性和安全性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 肌腱干细胞（TSCs）是来源于肌腱组织的一种具有高度增殖潜能、正常情况下分化为肌腱细胞的一种前体细胞，2007年Bi等首次从兔肌腱内分离，并证实TSCs具有成骨、成脂、成软骨等多向分化潜能，大量研究表明外源性TSCs有可能成为肌腱损伤和肌腱病细胞治疗的重要手段。TSCs在体外的生物学行为变化及在体内的定植和迁移变化是TSCs相关研究的核心问题之一；有效、安全的标记方法对所移植的TSCs进行示踪对其相关基础和临床研究至关重要。 国外有关TSCs的研究均集中于其分子生物学特性的相关研究，而对于其体内移植的示踪及观察等临床应用研究尚无相关报道。目前干细胞标记方法较多，均存在各自的优缺点。通过查阅大量文献，我们发现，SPIO、LV-GFP标记技术可能适合于TSCs的体内外标记示踪。结合SPIO可活体、无创示踪，适用于临床推广的优点，以及慢病毒（LV，Lentivirus）介导的GFP转染示踪操作简便、成本低廉、荧光表达稳定的优点，本课题拟对SPIO、LV-GFP标记TSCs方法的有效性、安全性进行探讨。 目的： 1.在文献报道基础上，改进TSCs酶消化法，建立稳定高效的TSCs分离、获取方法； 2.探索SPIO及LV-GFP两种细胞示踪标记方法合适的标记条件，分析它们对TSCs标记的有效性和安全性，及其对TSCs生物学特性的影响； 3.观察上述方法在体内标记、示踪的有效性； 通过本课题研究，拟为TSCs的体内外示踪提供有效和安全的技术方法和理论支持。 方法： 1.在国外文献报道的基础上，将传统酶消化-过滤法予以改进，不过滤而直接种植来分离、培养大鼠TSCs，并利用流式分析、免疫荧光、多向诱导分化等手段对该法获取的TSCs进行鉴定。 2.采用葡聚糖包裹的SPIO和慢病毒介导的绿色荧光蛋白两种标记手段对TSCs进行标记，观察SPIO浓度对TSCs标记有效率、体外标记后MRI检测效率及其对TSCs的生长曲线的影响； 3.摸索不同MOI值Lv-GFP对TSCs标记的有效率、体外标记传代衰减情况、检测其对TSCs干性的影响，选择合最佳的MOI值。 4.建立大鼠跟腱急性断裂模型，将示踪标记的TSCs在损伤部位注射，，于损伤早期（1周）及瘢痕重建后（6周）取材，观察经标记的TSCs在急性跟腱断裂模型中的迁移、定植情况，证实该示踪方法的有效性。 结果： 1.通过我们改进的TSCs酶消化法，一只实验动物即可获取4瓶原代细胞，较传统酶消化-过滤法，该法可多量、更稳定的获取原代细胞；该法提取的TSCs形态、克隆形成能力及增殖能力符合干细胞特征；Ⅰ型胶原、胚胎表面抗原SSEA4、Oct4表达阳性，Ⅲ型胶原表达阴性；干细胞表面标记物CD90、CD44呈阳性表达；CD34、CD106呈阴性表达；在体外诱导的情况下TSCs具有明确的成脂、成骨和成软骨分化能力。 2.葡聚糖包裹的SPIO能够标记TSCs，标记有效率随SPIO浓度增大而增加，作用浓度达到8ug/ml时标记效率95%，细胞内能够有效观察到铁颗粒吞噬，但其对TSCs的增殖影响很大。 3. LV-GFP在体外能够有效标记TSCs，标记有效率随感染复数（MOI值）增加而增加，最佳MOI值为500，荧光强度值不随体外传代而减低，对成脂、成骨、成软骨相关基因无明显影响。 4.外源性TSCs经过LV-GFP标记后，能够在异体正常肌腱内随肌腱纤维的走行定植，在急性跟腱断裂模型中定植于断裂部位及形成的瘢痕中，超过6周仍能有效观察。 结论： 1.经过我们改进的酶消化法分离、培养大鼠跟腱来源TSCs可靠、有效，能够更多且稳定的获取TSCs；经鉴定，该方法提取的TSCs具有明确的干细胞特性，有多向分化潜能。 2.葡聚糖包裹的SPIO虽然能够可靠标记大鼠TSCs，但对其增殖能力影响过大，可能不适用于TSCs的标记示踪，其他剂型的SPIO对TSCs标记特性仍有待进一步研究。 3.慢病毒介导的GFP在体外对TSCs示踪标记有效可靠，标记有效率不随长期传代而降低，对其干性无明确影响，是一种针对TSCs的可靠有效的示踪标记物。 4.外源性TSCs经过LV-GFP标记后，能够观察到其大鼠跟腱内的定植和迁移，LV-GFP在体内也能够有效标记并示踪TSCs，对TSCs是一种有效的标记示踪方法。
【关键词】：肌腱干细胞 SPIO LV-GFP 细胞示踪
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 研究意义12
• 1.3 研究内容12
• 1.4 研究方法12-13
• 第二章 大鼠跟腱来源肌腱干细胞分离培养及鉴定13-25
• 2.1 引言13
• 2.2 材料与方法13-18
• 2.3 结果18-23
• 2.4 讨论23-24
• 2.5 小结24-25
• 第三章 SPIO 对体外 TSCs 标记的有效性及对其生物活性的影响25-38
• 3.1 引言25
• 3.2 材料与方法25-29
• 3.3 实验结果29-36
• 3.4 讨论36-37
• 3.5 小结37-38
• 第四章 LV-GFP 对体外 TSCs 标记的有效性及对其生物活性的影响38-50
• 4.1 引言38
• 4.2 材料与方法38-43
• 4.3 实验结果43-48
• 4.4 讨论48-49
• 4.5 小结49-50
• 第五章 Lv-GFP 标记 TSCs 在大鼠跟腱修复过程的有效性分析50-59
• 5.1 引言50
• 5.2 材料与方法50-53
• 5.3 实验结果53-57
• 5.4 讨论57
• 5.5 小结57-59
• 全文结论59-60
• 参考文献60-65
• 文献综述65-72
• 参考文献70-72
• 硕士期间发表和待发表的文章72-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 居胜红 ,滕皋军;干细胞的磁粒子标记和磁共振示踪[J];中国CT和MRI杂志;2005年03期

2 林肖;王凤玲;陈加荣;林兴德;杨柳;;PEI-SPIO标记对关节软骨细胞生物学特性的影响[J];第三军医大学学报;2013年04期

3 谌志强;段惠丽;李君文;王新为;金敏;王景峰;陈照立;晁福寰;;葡聚糖纳米磁颗粒的制备及表征[J];解放军预防医学杂志;2007年06期

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5 李东,柳向东,肖开颜,舒朝锋,崔磊,刘伟,曹谊林;接种浓度对人骨髓基质干细胞在脱钙骨上生长和分布的影响[J];上海第二医科大学学报;2004年04期

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本文编号：412360