乙型脑炎病毒入侵神经细胞的内吞机制研究

发布时间：2017-06-08 15:04

  本文关键词：乙型脑炎病毒入侵神经细胞的内吞机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），在分类学上属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）成员，为有包膜的单正链RNA病毒。JEV是流行性乙型脑炎的病原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后引发严重的急性神经系统症状，对人类健康威胁巨大。乙型脑炎主要流行于东亚、东南亚地区，近年来其传播范围有明显扩大的趋势，发病率也有所上升，可见JEV感染仍然是危害公众健康的重大问题，急需深入研究JEV的致病机理并寻找新的抗病毒靶点。 病毒感染宿主细胞需要经过一个完整的复制周期，包括病毒的吸附、穿入细胞内、脱壳、生物合成、病毒颗粒的装配、释放等过程，这本身也是病毒与宿主细胞相互作用。为了有效感染宿主细胞，病毒必须先要侵入宿主细胞内，大多数包膜病毒与靶细胞结合以后利用细胞内吞方式作为侵入宿主细胞的途径，这些内吞途径包括：网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediated endocytosis）、膜穴样凹陷介导的内吞（Caveola-mediated endocytosis）、巨胞饮作用（Macropinocytosis）和网格蛋白、膜穴样凹陷非依赖型内吞（Clathrin-and Caveola-independent endocytosis）等。黄病毒属病毒入胞途径多样且复杂，甚至同一种病毒的不同亚型入侵同一种细胞的内吞机制也不相同；然而，关于JEV如何利用宿主细胞固有运输元件完成病毒内吞，及其精确的调控机制未见报道。 本课题以大鼠神经母细胞瘤细胞（B104细胞）为研究对象，针对JEV（疫苗株SA14-14-2株）的入胞过程，通过化学抑制剂阻断、细胞内过表达显性抑制突变体以及RNA干扰（RNAi）等方法，系统分析了JEV利用何种宿主细胞元件，通过何种内化途径侵入神经细胞。本研究首先建立了JEV感染的神经细胞模型，并通过病毒动力学实验，分析JEV入侵B104细胞的内化速率及动力学特征。然后，选用针对不同细胞内吞途径的化学抑制剂分别阻断各条内吞途径，包括网格蛋白依赖的途径、膜穴样凹陷依赖的途径、发动蛋白（Dynamin）依赖的途径、胆固醇（Cholesterol）依赖的途径、以及低pH依赖的途径等，观察上述处理对JEV和单周期JEV假病毒（JEVpv）入侵神经细胞的影响。继而，通过外源转染特异性的显性抑制突变体或小干扰RNA，破坏各内吞途径的关键分子，进一步分析和确认JEV入侵所依赖的内吞途径。在以上研究基础上，通过化学抑制剂阻断法，观察JEV不同基因型病毒株入侵B104细胞的内吞途径是否存在株特异性；同时，采用化学抑制剂阻断法比较分析JEV入侵神经细胞和非神经细胞的内吞途径的异同。 本研究的主要结果和结论如下： 1. JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径 通过网格蛋白抑制剂Chlorpromazine、细胞内过表达EPS15蛋白显性抑制突变体以及下调网格蛋白表达等方法，可阻断网格蛋白介导的内吞途径；然而上述处理并不影响JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵B104细胞不通过网格蛋白依赖型内吞途径。 2. JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞依赖发动蛋白 利用发动蛋白抑制剂Dynasore、外源转染Dynamin II K44A显性抑制突变体或针对Dynamin的特异性小干扰RNA，能够破坏发动蛋白的功能，并明显抑制了JEV和JEVpv的内吞，表明JEV入侵B104细胞依赖发动蛋白的作用。 3. JEV通过膜穴样凹陷（Caveola）介导的内吞途径入侵大鼠神经母细胞瘤细胞 当B104细胞与胆固醇抑制剂MβCD和Filipin作用后，细胞膜胆固醇及Caveola的结构完整性被破坏。这两种抑制剂能够明显的抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV的入侵依赖胆固醇和Caveola。在靶细胞内过表达Caveolin-1显性抑制突变体或下调Caveolin-1的表达，可阻断Caveola介导内吞的功能，并显著抑制了JEV的入侵能力。此外，采用化学抑制剂Genistein抑制Caveola内吞途径的信号通路，也能够明显地抑制JEVpv的内吞。为了更直观的检测JEV的内吞途径，我们通过免疫荧光法标记Caveola依赖型内吞途径标志分子霍乱毒素B (CTB)以及Caveolin-1，并观察在病毒内吞过程中它们与JEV病毒颗粒的分布情况。激光共聚焦结果显示，绝大多数JEV病毒颗粒与胞内CTB以及Caveolin-1分子共定位。以上结果表明JEV通过膜穴样凹陷（Caveola）介导的内吞途径入侵B104细胞。 4. JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞不依赖细胞巨胞饮作用 通过EIPA或Wortmannin阻断细胞的巨胞饮途径，或干扰PI3K表达以抑制巨胞饮依赖的信号通路，均不能抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵不依赖细胞巨胞饮作用。 5. JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞依赖酸性pH环境 利用内体酸化抑制剂Chloroquine和Ammonium Chloride来提升内体pH能够明显抑制JEV的入侵。在维持内体低pH环境中发挥质子泵作用的VATPase被下调后，JEVpv的感染能力也受到显著抑制，提示JEV入侵依赖内体酸性pH环境。 6. JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞的内吞途径不存在株特异性 采用不同化学抑制剂阻断各条内吞途径，分析对JEV基因III型病毒株SA14和基因I型病毒株SH-53入侵的影响。我们发现，这两种基因型的JEV病毒株与疫苗株SA14-14-2株的入侵方式相同，均通过Caveola介导的、发动蛋白和pH依赖型的内吞途径入胞，表明JEV入侵B104细胞所依赖的内吞途径不存在株特异性。 7. JEV入侵非神经类细胞不同于入侵大鼠神经母细胞瘤细胞所依赖的内吞途径 分别将针对不同内吞途径的化学抑制剂作用于B104、Vero、CHO和Huh7细胞分析对JEV入侵的影响。结果显示，JEV通过网格蛋白介导的内吞途径入侵Vero，CHO和Huh7细胞；而入侵B104细胞则通过Caveola介导的内吞途径，提示JEV入侵神经类细胞所依赖的内吞途径不同于其它非神经细胞。 综上所述，本研究系统的分析了JEV入侵大鼠神经母细胞瘤细胞的内吞途径及作用机制，证明JEV入侵B104细胞是通过膜穴样凹陷（Caveola）介导的、发动蛋白和pH依赖型的内吞途径。这种内吞途径有别于JEV感染非神经细胞的入侵方式，也与其它黄病毒属成员的内吞机制不同，可能与JEV的神经嗜性和致病性相关。阐明JEV入侵神经细胞过程中所利用的固有元件，，以及精确的调控机制，有助于我们更好地理解、认识病毒的致病机理，为寻找新的药物治疗靶点提供理论依据。
【关键词】：乙型脑炎病毒 入侵 神经细胞 内吞途径
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.31
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文缩略词表11-13
• 一、前言13-15
• 二、材料15-21
• 三、实验方法21-28
• （一）细胞培养21
• （二）JEV 扩增及滴度测定21-22
• （三）JEV 感染实验及感染性测定22-23
• （四）JEV 假病毒的制备及感染23
• （五）JEV 结合及入侵动力学实验23-24
• （六）化学抑制剂作用24-25
• （七）细胞转染25
• （八）免疫荧光25-26
• （九）免疫印迹（Western blotting）26-27
• （十）胆固醇定量实验27
• （十一）统计学分析27-28
• 四、结果28-57
• （一）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞的动力学特征28-30
• （二）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径30-35
• （三）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞依赖发动蛋白35-40
• （四）JEV 通过膜穴样凹陷（Caveola）介导的内吞途径入侵大鼠神经母细胞瘤细胞40-47
• （五）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞不依赖细胞巨胞饮作用47-49
• （六）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞依赖酸性 pH 环境49-53
• （七）JEV 不利用网格蛋白介导的内吞途径和巨胞饮作用作为细胞入侵的次要途径53-54
• （八）JEV 入侵大鼠神经母细胞瘤细胞的内吞途径不存在株特异性54-55
• （九）JEV 入侵非神经类细胞不同于入侵大鼠神经母细胞瘤细胞所依赖的内吞途径55-57
• 五、讨论57-61
• 参考文献61-67
• 文献综述67-74
• 参考文献71-74
• 附录74-75
• 致谢75-76

【参考文献】

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1 孙芳;李玉霞;凌焱;梁龙;陈珊;陈惠鹏;;病毒入胞机制研究方法及其研究进展[J];微生物学通报;2010年01期

  本文关键词：乙型脑炎病毒入侵神经细胞的内吞机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：432858