Tg737基因在胎肝干细胞分化过程中的作用及机制研究

发布时间：2017-06-10 01:01

  本文关键词：Tg737基因在胎肝干细胞分化过程中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胎肝干细胞具有能分化为肝细胞和胆管上皮细胞的特点，为基础研究和临床应用搭建了更宽阔的平台，干细胞治疗各类肝脏疾病的构想和实践与再生医学的理念不谋而合，其前景是光明远大的。同时大量的研究表明干细胞与肿瘤干细胞有着微妙的联系，干细胞的分化异常可能导致恶变，甚至引发肿瘤。因此，正反两个方面都说明了探究胎肝干细胞正常分化过程中受到哪些关键分子、蛋白抑或信号通路的调控及其潜在机制的重要性和必要性。目的 本研究以胎肝干细胞的正常分化为切入点，拟初步探索Tg737基因在胎肝干细胞分化过程中所起的作用及其潜在的分子机制。研究内容分为两部分：1、Tg737基因在胎肝干细胞分化过程中的表达及作用；2、初步探讨Tg737基因调控胎肝干细胞分化的机制。 方法 1.三步分离法收集胎肝干细胞；HGF（20ng/ml）诱导胎肝干细胞一周，选取第1、3、5、7天定为后续实验的检测点，PCR连续监测ALB和AFP的mRNA表达变化；在上述4个时间点，Western blot连续监测Tg737蛋白的表达变化；慢病毒Tg737-shRNA转染胎肝干细胞，分为实验组和对照组，PCR、Western blot检测沉默效果；流式细胞术连续检测两组细胞的CD133表达变化；PCR连续监测两组细胞ALB和AFP的表达变化；在培养第7天，，透射电镜观察两组细胞的超微结构差异。 2. PCR、Western blot连续监测HNF4α在正常胎肝干细胞分化过程中的表达变化；在培养第7天以Western blot、PCR检测实验组和对照组细胞中HNF4α蛋白和mRNA的表达情况；免疫荧光技术检测两组细胞中β-catenin的表达情况；Western blot检测两组细胞中Snail蛋白的表达情况。 结果 1.三步分离法能有效富集胎肝干细胞；在HGF（20ng/ml）诱导正常胎肝干细胞的第1、3、5、7天，AFP的mRNA表达逐渐降低，ALB的mRNA表达逐渐升高；在诱导分化过程中，Tg737的蛋白表达逐渐升高；慢病毒-shRNA能有效下调Tg737的mRNA和蛋白表达；在HGF诱导分化过程中，流式细胞技术检测两组细胞CD133的表达，发现在第1天，二者的表达无显著差异，随着诱导的进行，相比对照组，实验组CD133表达的下降更缓慢，差异有统计学意义（p0.05）；实验组AFP和ALB的mRNA水平均无明显变化（p0.05）；在第7天以透射电镜观察两组细胞的超微结构：实验组的细胞核大且富含异染色质，胞质稀疏且细胞器极少，核质比大，细胞表面绒毛的数量稀少；对照组细胞的核质比很低，细胞都已极化，细胞质中含有大量的线粒体、溶酶体、发育良好的高尔基体等细胞器，显示出早期分化的特点。 2.在HGF（20ng/ml）诱导正常胎肝干细胞分化的第1、3、5、7天，PCR、Westernblot连续监测提示：HNF4α的mRNA和蛋白水平都逐渐增加（p0.05）；相比对照组，实验组HNF4α的mRNA和蛋白水平都显著下调（p0.05），核内的β-catenin表现出更强的免疫反应性即Wnt/β-catenin呈过度激活表现，Snail蛋白表达上调。 结论 1.三步分离法能有效富集胎肝干细胞，HGF（20ng/ml）能有效诱导胎肝干细胞向正常肝细胞分化。 2. Tg737基因参与调控胎肝干细胞向正常肝细胞的分化，抑制Tg737的表达导致胎肝干细胞分化受阻。 3. HNF4α参与胎肝干细胞的正常分化过程；Tg737基因的缺失导致HNF4α表达下调，Wnt/β-catenin信号通路过度激活，并可能通过促进胎肝干细胞发生EMT，从而抑制其正常分化。
【关键词】：胎肝干细胞 分化/抑分化 Tg737 HNF4α β-catenin EMT/MET
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-38
• 一、肝干/祖细胞14-23
• 二、Tg73723-30
• 三、HNF4α30-38
• 实验一 TG737基因在胎肝干细胞分化过程中的表达及作用38-56
• 1 引言38
• 2 材料38-41
• 3 方法41-47
• 4 结果47-53
• 5 讨论53-56
• 实验二 TG737基因调控胎肝干细胞分化的机制研究56-68
• 1 引言56
• 2 材料56-57
• 3 方法57-60
• 4 结果60-64
• 5 讨论64-68
• 小结68-69
• 参考文献69-81
• 个人简历和研究成果81-83
• 致谢83-84

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