人PTH的表达纯化及其免疫吸附剂的制备

发布时间：2017-06-11 16:03

  本文关键词：人PTH的表达纯化及其免疫吸附剂的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)是尿毒症的主要毒性物质之一,几乎所有的肾衰竭患者体内含有过高的PTH,过高的PTH使肾衰竭患者处于一种高危状态,严重影响肾衰竭患者生存质量及生存率。目前针对高PTH的治疗方法包括3种：药物治疗、外科手术和血液净化。药物和手术治疗易复发,且具有较大副作用。血液净化方式被认为是一种有效的、很有发展前景的治疗方式。已有的血液净化疗法对PTH的去除能力有限且选择性低。为了提高吸附剂的选择性和安全性,本论文利用稳定性高,安全性好的特异性IgY为配基,制备了以人PTH为目标分子的免疫吸附剂并考察该吸附剂对PTH的吸附能力。本论文的研究内容包括以下几部分： (1)PTH的原核表达。通过基因工程技术,分别构建了重组质粒pET23a-PTH、 pET21b-PTH; PTH在含有pET23a-PTH和pET21b-PTH的E.coli BL21(DE3)中均获得可溶表达,其中E.coli BL21(DE3)-pET23a-PTH的表达量高,因此选择pET23a-PTH作为目的蛋白表达的重组质粒。通过对菌体的培养条件的优化,确定了最终的培养条件为：菌体37℃活化过夜后,1%接菌于50mL LB培养基,培养3h后,0.1mMIPTG诱导继续培养4h,目的蛋白表达量约为0.1mg/mL,达到总蛋白的30%。 (2)PTH的纯化。菌体经冰浴超声破碎,0.12%(w/v) PEI沉淀,50%饱和度的硫酸铵沉淀,pH3.5柠檬酸缓冲液等电点沉淀,SP强阳离子交换层析得到终产品。终产品经SDS-PAGE SEC-HPLC及RP-HPLC检测,纯度达到95%以上。对终产品进行了鉴定分析,MALDI-TOF-MS测得分子量为9406.777Da,与理论分子量基本一致,免疫荧光检测发现其具有良好的免疫原性。 (3)PTH免疫吸附剂的制备。将获得的PTH终产品作为抗原免疫蛋鸡,经Western blot和间接ELISA检测所获卵黄内产生较高效价IgY特异性抗体；IgY经去除脂质,硫酸铵沉淀等步骤初分离后,利用Sepharose-PTH免疫亲和柱进行亲和纯化,纯度达92%；将纯化得到的抗-PTH IgY固载于羰基二咪唑(N, N'-carbonyldiimidazole, CDI)活化的琼脂糖凝胶上制备免疫吸附剂,吸附剂对各肾衰竭患者血清样品中的PTH均有良好去除效果,去除率为40-60%。 总之,通过本论文的研究,获得了对肾衰竭患者血清中PTH具有良好去除效果的免疫吸附剂,为其作为血液净化装置的吸附填料用于患者血液中甲状旁腺激素的清除奠定了良好基础。
【关键词】：甲状旁腺激素 卵黄抗体 亲和纯化 免疫吸附
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文献综述11-29
• 1.1 慢性肾衰竭11-12
• 1.1.1 慢性肾衰竭概述11-12
• 1.1.2 慢性肾衰竭的治疗12
• 1.2 甲状旁腺激素及其致病机理12-17
• 1.2.1 甲状旁腺激素概述12-15
• 1.2.2 甲状旁腺激素致病机理15
• 1.2.3 继发性甲状旁腺功能亢进的治疗15-17
• 1.3 基因重组蛋白纯化与鉴定技术17-22
• 1.3.1 蛋白纯化技术的选择策略与组合17-20
• 1.3.2 重组蛋白的定量与定性分析20-22
• 1.4 卵黄抗体技术22-27
• 1.4.1 卵黄抗体特征22-24
• 1.4.2 卵黄抗体的提取和分离纯化24-26
• 1.4.3 卵黄抗体的检测26-27
• 1.5 本论文的研究基础、目标和主要内容27-29
• 2 重组蛋白PTH的原核表达29-42
• 2.1 绪论29
• 2.2 实验材料29-31
• 2.2.1 材料和试剂29-30
• 2.2.2 主要仪器30-31
• 2.3 实验方法31-35
• 2.3.1 目的基因的合成31-32
• 2.3.2 重组质粒的构建32-33
• 2.3.3 BCA法测定总蛋白含量33-34
• 2.3.4 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化34
• 2.3.5 重组蛋白的可溶性检测34
• 2.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳34
• 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳34-35
• 2.4 实验结果与讨论35-40
• 2.4.1 重组质粒的构建、目的片段转化及蛋白表达35-37
• 2.4.2 重组蛋白的可溶性检测37
• 2.4.3 重组蛋白的表达条件优化37-40
• 2.5 小结40-42
• 3 重组蛋白PTH的分离纯化42-56
• 3.1 绪论42
• 3.2 实验材料42-43
• 3.2.1 材料和试剂42
• 3.2.2 主要仪器42-43
• 3.3 实验方法43-46
• 3.3.1 菌体的破碎43
• 3.3.2 聚乙烯亚胺沉淀43
• 3.3.3 硫酸铵沉淀43-44
• 3.3.4 等电点沉淀44
• 3.3.5 SP强阳离子交换层析44-45
• 3.3.6 重组蛋白的纯度分析45
• 3.3.7 重组蛋白性质检测45-46
• 3.4 实验结果与讨论46-55
• 3.4.1 裂解缓冲液离子强度优化46
• 3.4.2 聚乙烯亚胺沉淀条件优化46-48
• 3.4.3 硫酸铵沉淀条件优化48
• 3.4.4 等电点沉淀条件优化48-49
• 3.4.5 SP强阳离子交换层析条件优化49-51
• 3.4.6 重组蛋白的纯度分析51-53
• 3.4.7 纯化工艺总结53-54
• 3.4.8 重组蛋白性质检测54-55
• 3.5 小结55-56
• 4 PTH免疫吸附剂的制备及性能评价56-70
• 4.1 绪论56
• 4.2 实验材料56-57
• 4.2.1 材料和试剂56-57
• 4.2.2 主要仪器57
• 4.3 实验方法57-62
• 4.3.1 动物免疫57-58
• 4.3.2 Bradford法测定总蛋白含量58
• 4.3.3 IgY的分离提取58-59
• 4.3.4 IgY的特异性检测59
• 4.3.5 IgY的效价检测59-60
• 4.3.6 PTH免疫亲和柱的制备60-61
• 4.3.7 IgY的亲和纯化61
• 4.3.8 IgY免疫吸附剂的制备61-62
• 4.3.9 IgY免疫吸附剂对PTH的亲和常数测定62
• 4.3.10 IgY免疫吸附剂对PTH的去除效果评价62
• 4.3.11 IgY免疫吸附剂的特异性吸附评价62
• 4.4 实验结果与讨论62-69
• 4.4.1 IgY特异性检测62-63
• 4.4.2 免疫后特异性IgY效价变化测定63-64
• 4.4.3 硫酸铵沉淀纯化IgY条件优化64-66
• 4.4.4 IgY的亲和纯化66-67
• 4.4.5 IgY免疫吸附剂对PTH的亲和常数测定67-68
• 4.4.6 IgY免疫吸附剂对PTH的去除效果评价68
• 4.4.7 IgY免疫吸附剂的特异性吸附评价68-69
• 4.5 小结69-70
• 结论70-71
• 展望71-72
• 参考文献72-77
• 附录A 重组蛋白PTH(1-84)氨基酸序列77-78
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：441933