致倦库蚊Chymotrypsin-like蛋白与有机磷抗性关系的研究

发布时间：2017-06-13 02:06

  本文关键词：致倦库蚊Chymotrypsin-like蛋白与有机磷抗性关系的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蚊虫可以传播多种疾病，如西尼罗河病、疟疾、丝虫病、登革热、乙型脑炎等，对人类健康构成严重威胁。蚊虫的主要防治是化学防治，然而有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类农药的长期、广泛的使用，已引起蚊虫的抗药性。蚊虫抗药性的产生和发展，成为蚊虫防治的一个重大障碍。探究抗性分子机制有利于新型杀虫剂的研发。 本研究组前期采用抑制性差减杂交、构建差减文库及斑点杂交，，发现一个Chymotrypsin（CHY）基因在致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus对硫磷抗性品系中高表达。用BliastX软件在NCBI上进行比对，发现高表达的CHY与XM_001843342具有98.58%同源性。在此基础上，利用PCR技术扩增出CHY884bp片段，开放阅读框为849bp，预测编码282个氨基酸，大小为30.6KD。SignalP3.0分析在其C端有一个16aa的分泌信号肽。CHY家族有三个保守的活性位点His89、Asp138、Ser230，而本研究克隆的CHY只有一个活性位点Asp138，而另外两个活性位点已突变为Asn89和Arg230。 将CHY与pET28a载体连接，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，发现CHY在细胞裂解的沉淀中。用尿素提取纯化CHY后制备了多克隆抗体。将CHY与pFastbac载体连接，转染昆虫sf9细胞并表达，Western blot检测发现CHY位于细胞裂解沉淀中。以苯甲酰-酪氨酸乙酯（BTEE）为底物，没有检测到原核表达或真核表达细胞沉淀中CHY的活性。Western blot检测发现CHY蛋白在致倦库蚊体内为膜蛋白。 利用siRNA干扰致倦库蚊细胞中CHY的表达，经过实时定量PCR验证，干扰效率为76.86%。在无任何农药时，干扰组细胞存活率与对照组相比没有差异；在对硫磷浓度15ppm、对氧磷浓度3.5ppm和5ppm、久效磷的浓度20ppm时，干扰组细胞存活率分别比对照组降低9.90%、6.96%、15.83%、20.04%(p0.05)，说明CHY与致倦库蚊对有机磷杀虫剂产生抗性相关。 通过去除一个致倦库蚊野生种群的乙酰胆碱酯酶G119S突变引起的靶标抗性、筛选低活性的羧酸酯酶、P450单加氧酶和谷胱甘肽-S-转移酶，建立了一个对杀虫剂敏感的致倦库蚊品系。该品系的羧酸酯酶活性是敏感品系S-lab的2.5倍，P450和GST的活性与S-lab相当。生物测定表明，与S-lab相比，该品系对有机磷杀虫剂有低于2倍的抗性，对氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂没有抗性，可以作为敏感标准品系用于抗性监测。
【关键词】：致倦库蚊 抗药性 Chymotrypsin 体外表达 siRNA干扰
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R384.1
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8-13
• 1. 蚊虫与相关传染病8
• 2. 蚊虫防治和抗性8-10
• 2.1 蚊虫防治8
• 2.2 蚊虫抗性水平8-9
• 2.3 蚊虫抗性机制9-10
• 3. CHY 研究进展10-12
• 3.1 CHY 合成和激活10
• 3.2 CHY 生化性质10-11
• 3.3 功能研究11-12
• 3.4 展望12
• 4. 论文研究的背景和意义12-13
• 第一章 致倦库蚊 CHY 基因克隆与鉴定13-19
• 1、材料和方法13-14
• 1.1 材料13
• 1.2 方法13-14
• 2、结果与分析14-18
• 2.1 PCR 产物14
• 2.2 菌落 PCR 鉴定14-15
• 2.3 致倦库蚊 CHY 序列分析15-16
• 2.4 进化树分析16-18
• 3、本章小结18-19
• 第二章 CHY 基因体外表达19-29
• 1、材料和方法19-25
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-25
• 2、结果与分析25-28
• 2.1 PCR 产物25-26
• 2.2 pMD18-T/CHY1、pMD18-T/CHY2 质粒鉴定26
• 2.3 pET28a/CHY、pFastBac/CHY 阳性克隆鉴定26-27
• 2.4 融合蛋白在 BL21 中的表达27
• 2.5 抗体检测及 sf9 表达蛋白鉴定结果27-28
• 2.6 融合蛋白酶活鉴定28
• 3、本章小结28-29
• 第三章 CHY 低表达对蚊细胞杀虫剂抗性的影响29-37
• 1、材料与方法29-33
• 1.1 材料29
• 1.2 方法29-33
• 2、结果与讨论33-36
• 2.1 Negative control FAM 转染效率33-34
• 2.2 siRNA 干扰效率34-35
• 2.3 siRNA 干扰后蚊细胞增长的变化35
• 2.4 siRNA 干扰 CHY 后蚊细胞对杀虫剂抗性的变化35-36
• 3、本章小结36-37
• 第四章 一个致倦库蚊杀虫剂敏感品系的筛选37-41
• 1、材料和方法37-38
• 1.1 材料37
• 1.2 方法37-38
• 2、结果与分析38-40
• 2.1 筛选无乙酰胆碱酯酶靶标抗性的单雌系38
• 2.2 单雌系羧酸酯酶、GST、P450 酶活性38-39
• 2.3 4 号单雌系的羧酸酯酶多态性39
• 2.4 4 号单雌系的抗性水平39-40
• 3、本章小结40-41
• 全文总结和展望41-42
• 参考文献42-48
• 期间的研究成果及发表的学术论文48-49
• 致谢49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 华小梅,江希流;我国农药的生产使用状况及其对环境的影响[J];环境保护;1999年09期

2 乔传令,J.Hemingway,李tD;有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析[J];昆虫学报;2003年01期

3 王琛柱，钦俊德;棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定[J];昆虫学报;1996年01期

4 崔峰;乔传令;;蚊虫抗药性分子机理[J];昆虫知识;2007年05期

5 刘剑;;中国农药产业市场结构研究[J];科协论坛(下半月);2009年06期

6 丁俊;;疟疾流行现状研究进展[J];中国公共卫生;2012年05期

7 刘斯璐;崔峰;燕帅国;乔传令;;中国媒介蚊虫对有机氯类和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性调查[J];中国媒介生物学及控制杂志;2011年01期

8 常海静;刘洋洋;江红;乔传令;卢希平;郎明林;崔峰;;酯酶显色法快速检测尖音库蚊对有机磷的抗性[J];中国媒介生物学及控制杂志;2011年04期

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本文编号：445453