蓝藻抗病毒蛋白CVN及衍生物抗甲型流感体内外活性的研究

发布时间：2017-06-15 17:10

  本文关键词：蓝藻抗病毒蛋白CVN及衍生物抗甲型流感体内外活性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲型流感严重影响着人类的生活生产，每年可引起几十万人死亡。目前，临床使用的抗流感专一性药物匮乏，并且病毒表面抗原极易漂变和转变，容易引起病毒的耐药性，因此对抗流感病毒新药的研发迫在眉睫。 蓝藻抗病毒蛋白N（CVN）是1997年发现的具有抑制多种包膜病毒活性的蛋白质，对甲型流感的抑制作用也不例外。但是CVN作为原核来源的小分子蛋白质，具有许多成药性的缺陷，为此本课题组最先在E. coli中高效可溶表达CVN的衍生物LCVN和PEG_(20k)-LCVN，希望可以获得毒性低，活性好，免疫原性小的潜在抗病毒药物。因此制备后的CVN及衍生物的生物活性评价非常关键，既是对前期工作的反馈也是对后期药物开发的指导。 本文从多个水平上评价CVN及衍生物的抗流感活性。分子水平上ELISA和血凝抑制实验同时说明CVN及衍生物可作用于不同病毒株表面糖蛋白HA，并且具有浓度依赖性。在细胞水平上，MTT法测定CVN，LCVN和PEG_(20k)-LCVN的细胞毒性依次降低。在抗病毒活性方面三种药物均可抑制不同毒株的增殖，其中PEG_(20k)-LCVN抗病毒的选择性指数最高。不同时间加药法说明CVN及其衍生物对病毒有直接灭活作用，干扰病毒的吸附，主要作用于病毒感染早期。鸡胚半体内和小鼠体内抗病毒实验结果表明，CVN及衍生物在活体内也有抑制病毒的活性，延长死亡时间，增加死亡保护率，减弱肺组织病变，降低肺指数和肺内病毒滴度。CVN及衍生物在体内外具有良好的抗病毒作用，可作为抗流感病毒潜在药物深入开发。
【关键词】：蓝藻抗病毒蛋白N 甲型流感病毒 聚乙二醇修饰 连接肽 血凝素 鸡胚 小鼠
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.13
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-5
• 目录5-7
• 第一章 前言7-18
• 1.1 甲型流感的研究现状7-9
• 1.1.1 流感简介7
• 1.1.2 甲型流感的结构、分类与复制7-9
• 1.2 甲型流感药物的研究现状9-13
• 1.2.1 流感疫苗9-10
• 1.2.2 临床用药10-11
• 1.2.2.1 M2 离子通道阻滞剂10-11
• 1.2.2.2 NA 抑制剂11
• 1.2.3 基于不同靶点的潜在药物11-13
• 1.2.3.1 HA 抑制剂11-12
• 1.2.3.2 RNA 聚合酶抑制剂12
• 1.2.3.3 siRNA 药物12
• 1.2.3.4 唾液酸酶融合蛋白（DAS181）12-13
• 1.3 CVN 的研究现状13-17
• 1.3.1 CVN 结构13
• 1.3.2 CVN 活性及作用机理13-15
• 1.3.2.1 抗免疫缺陷病毒(HIV)13-14
• 1.3.2.2 抗埃博拉病毒（Ebola virus）14
• 1.3.2.3 抗流感病毒（Influenza virus）14
• 1.3.2.4 抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）14
• 1.3.2.5 抗单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）14-15
• 1.3.3 CVN 的制备方法15-17
• 1.3.3.1 原核表达15
• 1.3.3.2 真核表达15
• 1.3.3.3 课题组前期制备的 CVN 及衍生物15-17
• 1.4 本课题的研究目的与意义17
• 1.5 技术路线17-18
• 第二章 材料与方法18-26
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 主要仪器与设备18
• 2.1.2 病毒，细胞，鸡胚及小鼠18
• 2.1.3 主要试剂与试剂盒18
• 2.1.4 主要试剂配方18-19
• 2.1.5 药物19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 ELISA 鉴定 CVN 及衍生物与 HA 蛋白的相互作用19
• 2.2.2 红细胞血凝抑制实验19-20
• 2.2.2.1 测定病毒血凝单位19-20
• 2.2.2.2 鉴定药物抑制血凝作用20
• 2.2.3 细胞水平检测 CVN 及衍生物抗 IAV 的活性20-21
• 2.2.3.1 药物细胞毒性测定20
• 2.2.3.2 病毒滴定和测定 EC5020
• 2.2.3.3 免疫荧光观察药物抗病毒的作用20-21
• 2.2.3.4 不同加药方式检测 CVN, LCVN 抑制流感复制的阶段21
• 2.2.4 CVN 及衍生物抗甲型流感病毒半体内鸡胚水平的实验研究21-22
• 2.2.4.1 鸡胚培养与病毒接种21-22
• 2.2.4.2 鸡胚尿囊液中病毒血凝效价的滴定22
• 2.2.5 CVN 及衍生物在小鼠体内抗甲型流感的实验研究22-26
• 2.2.5.1 流感病毒鼠肺适应株的建立22-23
• 2.2.5.2 小鼠死亡率实验23
• 2.2.5.3 鼠肺组织病毒检测与病变观察23-26
• 第三章 实验结果26-39
• 3.1 CVN 及衍生物与 HA 蛋白的相互作用26-27
• 3.2 CVN 及衍生物抑制红细胞凝集27
• 3.3 细胞水平上 CVN 及衍生物在 MDCK 抗 IAV 的作用27-30
• 3.3.1 CVN 及衍生物的细胞毒性27-28
• 3.3.2 CVN 及衍生物对四株流感病毒的半数有效浓度28-29
• 3.3.3 CVN 及衍生物的抗流感病毒的免疫荧光观察29-30
• 3.3.4 CVN 及 LCVN 在不同加药时间对流感病毒增殖的影响30
• 3.4 CVN 及衍生物在鸡胚半体内中的抗 IAV 活性30-32
• 3.4.1 病毒 EID5030-31
• 3.4.2 加药后鸡胚尿囊中病毒血凝滴度31-32
• 3.5 鼠肺适应株及其半数致死率(LD50)32-33
• 3.5.1 适应株的建立32-33
• 3.5.2 传代株 LD5033
• 3.6 死亡保护实验33-36
• 3.6.1 小鼠体重变化33-34
• 3.6.2 CVN 及 LCVN 对感染小鼠死亡保护实验结果34-36
• 3.7 肺指数变化36
• 3.8 肺中病毒量检测36-37
• 3.9 肺组织切片与染色37-39
• 第五章 讨论39-43
• 总结与展望43-44
• 参考文献44-48
• 附录1 硕士期间发表论文48-49
• 致谢49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘宗涛;于红;尹延梅;李丹;张文卿;;重组蓝藻抗病毒蛋白N的纯化复性及其抗单纯疱疹病毒1型活性的研究[J];中国海洋药物;2008年03期

2 安立冰;刘宗涛;于红;;重组蓝藻抗病毒蛋白N抗单纯疱疹病毒2型作用的实验研究[J];社区医学杂志;2008年13期

  本文关键词：蓝藻抗病毒蛋白CVN及衍生物抗甲型流感体内外活性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：453020