转录因子FOXM1在细胞氧化应激中特定功能的研究

发布时间：2017-06-16 01:05

  本文关键词：转录因子FOXM1在细胞氧化应激中特定功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：氧化应激是指机体细胞在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies,ROS）和活性氮自由基（Reactivenitrogenspecies,RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而对DNA、脂质和蛋白质等生物大分子造成损伤。p53是一个肿瘤抑制基因，它的活性主要依赖于翻译后修饰，如磷酸化，泛素化和乙酰化等。在正常细胞中，p53表达水平很低，但DNA损伤后，p53蛋白水平会急剧增加，一方面介导细胞周期停滞，为DNA损伤修复提供足够的时间；另一方面，p53蛋白的DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸行使DNA修复功能。 FOXM1是Forkheadbox转录因子家族的成员之一，与细胞增殖、衰老、DNA损伤修复、再生和肿瘤等许多生理病理过程都有密切关系。本课题通过DNA损伤标志物的检测及单细胞凝胶电泳分析，在细胞中建立了H2O2和紫外线诱导的氧化应激模型。此外，构建了干扰FOXM1表达的慢病毒载体，并分别制得滴度较高的FOXM1干扰慢病毒和FOXM1高表达慢病毒。在紫外线诱导人骨肉瘤细胞的氧化应激模型中，我们发现FOXM1的蛋白表达水平会上调，可见FOXM1在氧化应激中发挥作用，由此，我们设想干扰掉FOXM1的表达是否会对DNA氧化损伤修复产生影响。用单细胞凝胶电泳分析，发现紫外线处理24h后，干扰了FOXM1表达的细胞中DNA损伤程度很高，，这说明FOXM1能够帮助人骨肉瘤细胞抵抗氧化应激DNA损伤。实时荧光定量PCR检测一些DNA损伤修复相关基因的mRNA表达，发现氧化损伤重要修复通路碱基切除修复的相关基因PARP1，在干扰FOXM1表达后明显下调。其次，ATR的mRNA水平也明显下调，这些结果预示FOXM1可能通过调控PARP1和ATR等DNA损伤修复相关基因的表达参与氧化应激过程。综上所述，转录因子FOXM1在DNA氧化损伤应激中发挥重要作用。
【关键词】：氧化应激 p53 转录因子FOXM1 DNA损伤修复
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 英文缩写9-10
• 第1章 绪论10-20
• 1.1 细胞压力损伤10-14
• 1.1.1 氧化应激10-11
• 1.1.2 DNA损伤修复11-13
• 1.1.3 相关基因简介13-14
• 1.2 转录因子FOXM1概述14-18
• 1.2.1 转录因子FOXM1的结构14-15
• 1.2.2 转录因子FOXM1的功能15-18
• 1.3 诱导多能干细胞18-19
• 1.4 研究目的与方法19-20
• 第2章 细胞氧化应激模型构建20-32
• 2.1 前言20-21
• 2.2 实验材料21-22
• 2.3 实验方法22-29
• 2.3.1 细胞培养22
• 2.3.2 免疫印迹（immunoblotting）22-25
• 2.3.3 单细胞凝胶电泳25-26
• 2.3.4 半定量RT-PCR26-29
• 2.4 实验结果29-31
• 2.4.1 H2O2诱导的氧化应激模型建立29
• 2.4.2 UV诱导的氧化应激模型建立29-31
• 2.5 讨论31-32
• 第3章 FOXM1干扰及高表达体系的构建32-43
• 3.1 前言32
• 3.2 实验材料32-34
• 3.3 实验方法34-39
• 3.3.1 靶向人源FOXM1基因shRNA的设计及合成34
• 3.3.2 干扰载体的酶切与回收34-35
• 3.3.3 片段的连接与转化35-36
• 3.3.4. 重组质粒的鉴定36-37
• 3.3.5 质粒大提37-38
• 3.3.6 人源FOXM1干扰及高表达慢病毒制备38-39
• 3.4 实验结果39-41
• 3.4.1 质粒构建39
• 3.4.2 U2OS细胞FOXM1干扰体系的建立39-40
• 3.4.4 MEF细胞FOXM1高表达体系建立40-41
• 3.5 讨论41-43
• 第4章 FOXM1有助于U2OS细胞抵抗UV诱导的氧化应激43-49
• 4.1 前言43
• 4.2 实验材料43-45
• 4.3 实验方法45
• 4.3.1 实时荧光定量PCR45
• 4.4 实验结果45-47
• 4.4.1 FOXM1与氧化应激过程关联性的研究45-46
• 4.4.2 在U2OS中干扰FOXM1后对DNA损伤修复进程的影响46-47
• 4.4.3 在U2OS细胞中干扰FOXM1表达对DNA损伤修复相关基因的影响47
• 4.5 讨论47-49
• 总结与展望49-51
• 参考文献51-58
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录58-59
• 附录B FOXM1对氧化应激过程中P53表达水平的影响59-63
• 附录C 常用缓冲液和试剂配方63-64
• 致谢64

【共引文献】

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  本文关键词：转录因子FOXM1在细胞氧化应激中特定功能的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：453958