结核分枝杆菌特异性抗原Rv0315和Rv2971的克

发布时间：2017-06-16 18:06

  本文关键词：结核分枝杆菌特异性抗原Rv0315和Rv2971的克隆、表达及初步应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 由于艾滋病的蔓延、多种耐药结核菌的增多、移民,不少国家和地区对结核病控制的不重视等诸多原因，无论在发达国家还是在发展中国家，全球结核病形势正在急剧恶化，结核病患者人数一直不断增加。而能够快速、准确地诊断结核分枝杆菌感染，尤其是对菌阴肺结核和潜伏性感染的诊断，对结核病的控制工作具有非常重要的意义，诊断水平的提高也直接影响了对结核病的防控能力。由于目前临床上常用的检测方法存在涂片检出率低、培养周期长等诸多局限性，寻找新的快速准确的结核病诊断方法已成为当前国内外研究的热点。 目的 获得可以用于结核病诊断的新型标志物，克隆表达得到结核分枝杆菌特异性抗原Rv0315、Rv2971，评价单一抗原和复合抗原在体液免疫和细胞免疫诊断价值。 方法 分析结核分枝杆菌全基因序列，设计引物，通过分子克隆方法获得重组质粒pET21a-Rv0315、pET32a-Rv2971，转化后进行表达与纯化，得到重组蛋白Rv0315、Rv2971，采用Triton X-114相分离法去除内毒素，建立合适细胞和抗原浓度的ELISPOT方法，进行抗原组合，，ELISA法评价Rv0315、Rv2971、ESAT-6、CFP-10、复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在体液免疫诊断中的敏感性和特异性。分离外周血单个核细胞，用ELISPOT法评价Rv2971、复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在细胞免疫诊断中的价值。 结果 1．成功构建了重组质粒pET21a-Rv0315、pET32a-Rv2971，转化后进行表达纯化得到重组蛋白Rv0315、Rv2971，内毒素含量低于5EU/mg。 2．Rv0315、复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6、CFP-10、Rv2971的ELISA法检测的敏感性依次为20.8%（10/48）、37.5%（18/48）、31.3%（15/48）、25%（12/48）、4.2%（2/48），特异性依次为93.8%（30/32）、87.5%（28/32）、87.5%（28/32）、90.6%（29/32）、90.6%（29/32）。 3．ELISPOT法评价Rv0315、Rv2971、EAST6肽段库和CFP10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为58.3%（14/24）、16.7%（4/24）、75.0%（18/24）、66.7%（17/24），特异性依次为92.9%（13/14）、85.7%（12/14）、92.9%（13/14）、92.9%（13/14）； 4．Rv0315与ESAT-6总体阳性率相比，校正χ2=0.900，P=0.344；与CFP-10总体阳性率相比，χ2=0.125，P=0.727。Rv2971与ESAT-6总体阳性率相比，校正χ2=10.564，P=0.001；与CFP-10总体阳性率相比，χ2=6.667，P=0.007。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、EAST6肽段库和CFP10肽段库的敏感度依次为85.7%（60/70）、77.1%（54/70）、72.9%（51/70），特异性依次为82.4%（28/34）、85.3%（29/34）、88.2%（30/34）。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315与ESAT-6总体阳性率相比，χ2=4.167，P=0.031；与CFP-10总体阳性率相比，χ2=7.111，P=0.004。复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、EAST6肽段库和CFP10肽段库在菌阳肺结核组的阳性率依次为94.0%（47/50）、90.0%（45/50）、78.0%（39/50），在菌阴肺结核组的阳性率依次为65%（13/20）、45.0%（9/20）、60.0%（12/20）。 结论 1．采用Triton X-114相分离法能去除原核表达所产生的内毒素，内毒素含量符合免疫实验应用要求。 2．结核分枝杆菌特异性抗原Rv0315有望成为结核病诊断的候选抗原； 3．结核分枝杆菌特异性抗原Rv2971不具有较高的或潜在的免疫原性，不适用于作为结核病诊断的免疫学指标。 4．复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315有成为结核感染辅助诊断的潜力，值得进一步深入研究。
【关键词】：结核分枝杆菌 Rv0315 Rv2971 ESAT-6 CFP-10 肺结核 体液免疫 细胞免疫
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 中英文缩略词对照表11-12
• 前言12-15
• 1 材料15-20
• 2 方法20-25
• 3 结果25-34
• 4 讨论34-39
• 5 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述 细胞免疫在结核病诊断中的研究进展44-57
• 参考文献52-57
• 致谢57-59
• 个人简历及读研期间发表论文59

【参考文献】

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本文编号：456066