克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定

发布时间：2017-06-17 07:11

  本文关键词：克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探索克钦邦佤邦恶性疟原虫pfcrt基因的多态性 方法：1.应用Nest-PCR分别扩增MSP1、MSP2及Glurp基因中具有特异性的片段,进行基因分型,选出单一株。2.应用Nest-PCR扩增pfcrt基因上的两个片段,进行测序,再与标准株3D7的序列进行比对,得出基因突变结果。 结果：1.基因型鉴定：本实验通过对52株样本的MSP1、MSP2、GLURP进行基因型鉴定,获得39株单一感染细胞株。 2. pfcrt基因扩增结果：39株样本的pfcrt第71、72、74、75、76、77、97、144、148、152、160、163、194、220位点中,发现第71、72、74、75、76、220号位点存在突变,突变率分别为23.1%、23.1%、92.3%、89.7%、100.0%、100.0%；突变型为V71V、C72S、M74I、N75E、K76T、A220S;第77、97、144、148、152、160、163、194位点未见突变。 结论：1.MSP1、MSP2、Glurp基因分型发现有39株样本是单一感染株,其中13株来自克钦邦,26株来自佤邦。 2.39株样本的pfcrt的71、72、74、75、76、220号位点存在突变。克钦邦样本CVIETS型的突变率明显高于佤邦(P=0.0030.05)。 目的：测定克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的体外抗药性。 方法：将恶性疟原虫的单一株进行体外传代培养,同步化后进行抗疟药(氯喹、哌喹、青蒿琥酯、双氢青蒿素、奎宁)IC50值的测定。 结果：13株克钦邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值分别为690.9±243.2nM、65.71±23.8nM、1028±466.5nM、18.8±10.5nM和4.6+3.2nM；26株佤邦恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值分别为340.1±156.9nM、35.7±21.2nM、385.4±161.8nM、9.4±5.8nM和2.5+1.6nM；8株国际标准株(3D7、HB3、7G8、Dd2、W2、D10、K1和D6)对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素IC50值分别为205.5±225.9nM、15.3±13.2nM、387.0±267.9nM、14.0±6.6nM和2.4±1.8nM。 结论：1.氯喹：本实验39株恶性疟原虫中有1/39(25nM≤IC50值100nM)对氯喹为中度抗性株：有38/39(IC50值"g100nM)为高度抗性株；其中N11-1733和N11-966(IC50值1000nM)为严重抗药性虫株。氯喹的体外抗药性和pfcrt基因多态性有着密切的关系(P0.005)。 2.哌喹：39株恶性疟原虫中有1/39(F07-127.5nM)对哌喹为敏感株；有38/39(IC50值12.8nM)为抗性株；其中N11-966(IC50值100nM)为严重抗性株。 3.奎宁：39株恶性疟原虫中有22/39(IC5o值500nM)对奎宁为敏感株；有17/39(IC50值500nM)为抗性株；其中F07-12(IC50值2000nM)为严重抗性株。 4.青蒿琥酯：不同的参考标准对试验结论的影响较大。本文参考临界值计算公式结合加权法,得出其抗性临界值为29.6nM。39株恶性疟原虫中有38/39(IC50值29.6nM)对青蒿琥酯为敏感株；有1/39(IC50值40nM)为敏感性下降株。 5.双氢青蒿素：不同的参考标准对试验结论的影响本较大。本文参考药物体外抗性临界值计算公式(均数+2×标准差)结合加权法,得出其抗性临界值为7.7nM。39株恶性疟原虫中有37/39(IC5o值7.7nM)对双氢青蒿素为敏感株；有2/39(ICso值"g7.7nM)为敏感性下降株。 6.交叉抗药性：经研究发现,对于中缅边境地区的恶性疟原虫而言,氯喹和哌喹二者之间,青蒿琥酯、双氢青蒿素及奎宁三者之间存在交叉抗药性。 7.克钦邦佤邦39株恶性疟原虫对氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素的IC50值的研究中发现：两地区样本均不同程度的对氯喹、哌喹和奎宁产生了抗性,且佤邦样本对氯喹、哌喹和奎宁抗性低于克钦邦样本；两地区样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性也不相同,且佤邦样本对青蒿琥酯和双氢青蒿素的药物敏感性大于克钦邦样本。 目的：比较4℃冷藏同步化和山梨醇同步化这两种方法对体外测定药物IC50值的影响。 方法：按照配对Hotelling T2设计,将8株恶性疟原虫分为两组,分别应用4℃冷藏同步化和山梨醇同步化处理,然后进行4种抗疟药(氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁)IC50值的测定。 结果：4℃同步化后得到的8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素、奎宁的IC50值分别为270.8±189.7nM、22.2±12.2nM、1.5±0.9nM和398.4±162.8nM,山梨醇同步化后8株细胞对氯喹、哌喹、双氢青蒿素和奎宁的IC50值分别为261.0±178.7nM、25.4±15.8nM、1.4±1.0nM和380.7±162.6nM。 结论：经配对Hotelling T2检验发现：4℃冷藏同步化方法和山梨醇同步化方法对抗疟药IC50值的影响无显著性差异(P=0.8940.05)。
【关键词】：恶性疟原虫 MSP2 基因突变 pfcrt 恶性疟原虫 抗疟药IC_(50)值抗药性 恶性疟原虫IC_(50)值山梨醇同步化 4℃冷藏同步化
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 英文缩略词表7-9
• 中文摘要9-13
• 第一部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究9-10
• 第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定10-12
• 第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药抗性体外测定的影响12-13
• ABSTRACT13-17
• PART1 RESEARCH ON PFCRT OF PLASMODIUMFALCIPARUMISOLATES FROM KACHIN AND WA STATE13-14
• PART2 EX VTVO DRUG-RESISTANCE ASSAY OF FIVE ANTIMALARIALSON THE ISOLATES FROM WA STATE AND KACHIN STATE14-16
• PART3 COMPARE THE EFFECTS ON THE EX VIVO DRUG-SENSITIVITYASSAY SEPARATELY TREATED WITH TWO SYNCHRONIZATIONMETHODS -4℃ REFRIGERATION AND 5% SORBITOLUM16-17
• 引言17-22
• 1. 疟疾的流行情况17-20
• 2. 抗疟药及抗药性问题20-22
• 实验材料与方法22-47
• 1. 实验材料22-23
• 2. 实验仪器、试剂来源及配制23-28
• 3. 试验方法与步骤28-46
• 3.1. 恶性疟原虫的体外培养28-30
• 3.2. MSP2和PFCRT基因的扩增与检测30-37
• 3.2.1. PCR技术的基本原理30-31
• 3.2.2. 实验总路线31-37
• 3.3. 体外抗药性测定37-44
• 3.3.1. 实验原理37
• 3.3.2. 实验要求37
• 3.3.3. 实验总路线37-38
• 3.3.4 恶性疟原虫的配置38-40
• 3.3.5 药板制作40-43
• 3.3.6.IC50值的测定43-44
• 3.4 同步化对比试验44-46
• 3.4.1. 实验总路线44-45
• 3.4.2. 实验具体步骤45-46
• 4. 数据资料统计学分析46-47
• 结果47-68
• 第-部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究47-54
• 1. 基因分型结果47-48
• 2. PFCRT基因PCR扩增结果48-50
• 3. PFCRT突变结果50-54
• 第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定54-65
• 1. 体外抗药性测定结果54-57
• 2. 39株病人株和8株国际标准株对5种药物的IC_(50)值综合结果57-58
• 3. 克钦邦和佤邦样本对5种药物的IC_(50)值的比较58
• 4. 五种抗疟药(氯喹、哌喹、奎宁、青蒿琥酯和双氢青蒿素)之间的交叉抗药性58
• 5. 中缅边境病人株对5种抗疟药物抗性或敏感性的判断58-61
• 6. 氯喹IC_(50)值与PFCRT基因多态性的相关性61-65
• 第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药体外抗性测定的影响65-68
• 讨论68-78
• 第一部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫PFCRT基因多态性研究68-73
• 第二部分 克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定73-77
• 第三部分 4℃冷藏同步化法和山梨醇同步化法对抗疟药抗性体外测定的影响77-78
• 结论78-79
• 实验的创新性79-80
• 有待深入研究的问题80-81
• 参考文献81-89
• 附图89-90
• 论著90-111
• 硕士在读期间发表文章111-112
• 致谢112

【参考文献】

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1 杨恒林,刘德全,黄开国,杨亚明,杨品芳,廖明铮,张春勇;云南省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹、哌喹、甲氟喹、奎宁敏感性的体外测定[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1999年01期

  本文关键词：克钦邦佤邦恶性疟原虫对氯喹等五种抗疟药抗性的体外测定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：457702