类鼻疽伯克霍尔德菌全基因组测序及感染细胞模型的建立
发布时间：2017-06-21 01:02
本文关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌全基因组测序及感染细胞模型的建立，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：类鼻疽伯克霍尔德菌(B. pseudomallei)是一种革兰氏阴性杆菌，1911年首次在缅甸仰光分离到，运动活跃，可以通过气溶胶的形式传播。根据能否利用L-阿拉伯糖可以将其分为致病性和非致病性，不能利用L-阿拉伯糖的为致病性菌株。2006年美国CDC将其列为B类病原体，“9.11”之后美国更视其为生物恐怖剂。类鼻疽伯克霍尔德菌能导致一种危害严重的热带疾病，称为类鼻疽，临床表现为多发性脓肿，难治性肺炎和致死性的败血症，死亡率可达40%。我国海南、广东、广西和台湾等地都是类鼻疽的疫源地。随着地区输入性病例的增多，该病原体越来越受到重视，但在中国类鼻疽的研究还亟待加强。 开展类鼻疽的研究首先需要具有参考价值的标准株，但是由于涉及生物安全和生物威胁，难于直接从国外获取标准菌株。基因组测序是了解细菌遗传背景的最本质的方法。为此本研究筛选了一株临床B. pseudomallei进行全基因组测序并进一步分析其基因组的特点，以形成我国B. pseudomallei标准株。 同时，建立B. pseudomallei感染细胞模型是研究细菌与宿主细胞相互作用的前提。本研究拟以完成测序的B. pseudomallei BPC006为感染细菌，通过优化B. pseudomallei感染RAW264.7的各项参数，观察细胞受B. pseudomallei感染后细胞形态的特殊变化，检测宿主细胞的生化和免疫学指标，以期建立稳定的B. pseudomallei感染细胞模型。 方法 1.采用454测序仪对一株来自我国海南的B. pseudomallei BPC006进行全基因组测序。调用Newbler2.3软件、比照参考株B. pseudomallei strain1106a进行参考拼接，PCR、ABI3730测序仪补全漏洞(gap)后进行在线注释、纠错、提交、分析。 2.分别制备B. pseudomallei BPC006全菌超声抗原、甲醛灭活全菌抗原及热灭活全菌抗原，免疫BALB/c小鼠和家兔，制备其多抗血清。 3.通过透射电镜和荧光标记观察胞内细菌确认B. pseudomallei胞内感染，Giemsa染色和倒置显微镜动态观察细胞融合和多核巨细胞(multinucleated giant cells，MNGC)形成规律，计算侵袭率和检测促炎症因子，评价模型稳定性。 结果 1.完成了B. pseudomallei BPC006的全基因组序列测定，其序列号为：CP003781(1号染色体)和CP003782(2号染色体)，分析发现其基因组中有溶源性大片段的插入、缺失和突变，构建类鼻疽伯克霍尔德菌的系统发生树。 2. B. pseudomallei BPC006全菌免疫BALB/c小鼠和兔，ELISA和凝集效价高达1:64000和1:128，免疫荧光显示制备的抗体能与胞内B. pseudomallei BPC006菌体发生特异的抗原抗体反应。 3. MOI=100时B. pseudomallei感染RAW264.7细胞，细菌在胞内繁殖后促使细胞间发生融合，可见明显的MNGC形成，，1～24h炎症因子TNF-α呈“双峰”变化。 结论 1.首次对中国B. pseudomallei临床分离株进行了全基因组测序，建立了B.pseudomallei研究的标准株，得到了临床分离株B. pseudomallei BPC006的全序列，分析其遗传特点，为后续的类鼻疽流行病学调查、诊断及预防靶点的筛选提供了依据。 2.制备了针对B. pseudomallei BPC006全菌的多抗血清，为后续病原体的诊断和细胞微生物学研究提供了有效的工具。 3.建立了稳定的B. pseudomallei感染RAW264.7细胞模型，为研究病原菌与宿主细胞的相互作用奠定了基础。
【关键词】：类鼻疽伯克霍尔德菌 全基因组测序 细胞模型
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：
- 缩略语表4-6
- Abstract6-8
- 摘要8-10
- 第一章 前言10-14
- 第二章 类鼻疽伯克霍尔德菌基因组测序14-43
- 2.1 材料与方法14-24
- 2.2 结果与分析24-41
- 2.3 讨论41-43
- 第三章 类鼻疽伯克霍尔德菌感染 RAW264.7 细胞模型的建立43-57
- 3.1 材料与方法43-49
- 3.2 结果与分析49-55
- 3.3 讨论55-57
- 全文总结57-58
- 本研究的不足与展望58-59
- 参考文献59-67
- 文献综述一 类鼻疽的研究进展及诊疗现状67-73
- 参考文献72-73
- 文献综述二 类鼻疽伯克霍尔德菌基因组学概述及进展73-82
- 参考文献80-82
- 附件82-85
- 攻读硕士学位期间发表的论文及参与的课题85-86
- 致谢86
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本文编号：467254
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