CHD1L与人胚胎干细胞自我更新的初探

发布时间：2017-06-23 14:09

  本文关键词：CHD1L与人胚胎干细胞自我更新的初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)具有多谱系分化和自我更新能力,使得其在再生医学研究领域具有广泛的应用前景。但其自我更新和多能性的维持机制仍不清楚,有待进一步的研究。近年来发现了一系列的染色质修饰因子在hESCs的自我更新和多能性的维持中发挥重要的作用。CHD1L是在人肝癌细胞中发现的一个基因,主要与染色质解旋、DNA的损伤修复、细胞的增殖和凋亡等细胞过程相关。CHD1L在小鼠的内细胞团(inner cell mass, ICM)和小鼠胚胎干细胞中高表达。目前,尚未见到人hESCs对CHD1L的研究报道。 本研究通过构建可调控的CHD1L敲减和过表达的hESCs稳定系,研究CHD1L敲减和过表达后hESCs的自我更新、增殖、多能性和自我更新相关基因的转录是否发生改变,来研究CHD1L在hESCs的自我更新中发挥的作用。 研究发现,①CHD1L蛋白在]hESCs中高表达,在成纤维细胞中表达极低；并且CHD1L蛋白的表达随着hESCs的分化而下降；②CHD1L过表达和敲减均能够抑制iESCs的自我更新和细胞的增殖；③在hESCs中过表达CHD1L后自我更新和多能性相关基因的表达受到明显的抑制。总之,通过上述的研究可知CHD1L在hESCs的自我更新中发挥重要的作用,CHDIL的过表达和敲减均能够导致自我更新能力的降低,但具体的机制仍有待更为深入的研究来发现。
【关键词】：人胚胎干细胞 CHD1L 自我更新
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 专业名称~.写中英文对照表11-12
• 1 前言12-16
• 1.1 人胚胎干细胞12
• 1.2 人胚胎干细胞自我更新的维持12
• 1.3 人胚胎干细胞自我更新相关基因的研究方法12-13
• 1.4 推测CHD1L可能参与人胚胎干细胞的自我更新13-15
• 1.4.1 CHD1L基因的结构13
• 1.4.2 CHD1L的功能13-14
• 1.4.3 CHD1L与胚胎干细胞的自我更新14-15
• 1.5 研究CHD1L与人胚胎干细胞的自我更新的技术路线15-16
• 2 研究材料、试剂和耗材16-20
• 2.1 细胞和质粒载体16
• 2.2 细胞培养试剂16
• 2.3 分子实验试剂16-17
• 2.4 实验用耗材17-18
• 2.5 实验仪器18-19
• 2.6 引物列表19-20
• 3 实验技术和方法20-28
• 3.1 Gateway克隆方法20
• 3.1.1 利用高保真酶克隆目的基因的ORF片段20
• 3.1.2 BP克隆方法20
• 3.1.3 LR克隆方法20
• 3.1.4 连接产物的转化20
• 3.2 质粒DNA的抽提20-21
• 3.3 慢病毒颗粒包装21
• 3.4 人胚胎干细胞培养21-22
• 3.4.1 小鼠的Feeder支持下的hESCs培养方法21-22
• 3.4.2 hESCs的无饲养层培养体系22
• 3.4.3 培养基配方22
• 3.5 RNA的抽提和cDNA的合成22-23
• 3.5.1 RNA的抽提步骤22
• 3.5.2 cDNA的合成22-23
• 3.6 PCR检测23
• 3.7 realtime-PCR检测23
• 3.8 免疫荧光染色23-24
• 3.9 Western blot检测蛋白表达24-28
• 3.9.1 Western blot实验所需试剂配方24
• 3.9.2 细胞总蛋白质的提取24-25
• 3.9.3 测量所提蛋白质的浓度25
• 3.9.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)25-26
• 3.9.5 转膜(半干转)和封闭26
• 3.9.6 抗体杂交26-27
• 3.9.7 ECL化学发光显影27-28
• 4 实验结果28-55
• 4.1 CHD1L在人ESC和分化后细胞中的表达28-34
• 4.1.1 CHD1L在人ESC和成纤维细胞中的表达28-30
• 4.1.2 CHD1L在人ESC的EB分化中的表达变化30-34
• 4.2 CHD1L过表达和敲减质粒载体的构建34-40
• 4.2.1 构建CHD1L的诱导表达慢病毒质粒载体34-37
• 4.2.2 构建CHD1L诱导敲减的慢病毒质粒载体37-40
• 4.3 CHD1L过表达和敲减的人胚胎干细胞系的建立和鉴定40-46
• 4.3.1 过表达和敲减CI-ID1L的人ESC系的建立过程40-43
• 4.3.2 过表达和敲减CHD1L的ES细胞系进行鉴定43-46
• 4.4 CHD1L敲减和过表达影响人ESC的自我更新46-47
• 4.5 敲减和过表达CHD1L后对人ESC增殖的影响47-48
• 4.6 人ESC中过表达和敲减CHD1L后自我更新和多能性相关基因的表达48-51
• 4.7 CHD1L敲减和过表达对人ESC的EB分化的影响51-55
• 5 讨论55-58
• 5.1 CHD1L在hESC和分化后细胞中表达的比较55
• 5.2 hESC中敲减和过表达CHD1L均抑制其自我更新55-56
• 5.3 hESC中敲减和过表达CHD1L后抑制细胞的增殖56
• 5.4 hESC在过表达抑制多能性和自我更新相关基因的表达56
• 5.5 在hESC的EB分化中敲减和过表达CHD1L56-58
• 6 结论58-59
• 参考文献59-62
• 综述62-67
• 参考文献65-67
• 致谢67

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 劳艳萍;柯浩;孙洪亮;刘荣立;马玉洁;阮秋燕;雷钏;陆凤花;李湘萍;石德顺;;糖原合成激酶抑制剂在胚胎干细胞自我更新中的作用[J];中国畜牧兽医;2013年10期

2 袁存存;焦锋;胡海;;胃癌组织中CHD1L表达及其临床意义[J];山东医药;2014年10期

3 邓云刚;黄文峰;赖剑;刘晓平;邓龙颖;章新华;;CHD1L在结肠癌中表达与沉默对人结肠癌细胞迁移与侵袭的影响[J];世界华人消化杂志;2014年29期

4 邓云刚;黄文峰;赖剑;刘晓平;邓龙颖;章新华;;CHD1L在结直肠癌中的表达及其对细胞增殖的影响[J];世界华人消化杂志;2014年35期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 沈国芳;Rho GTP酶抑制剂辛伐他汀和Y27632调控小鼠胚胎干细胞心肌分化和自我更新机制研究[D];浙江大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 劳艳萍;GSK3抑制剂对水牛类胚胎干细胞培养效果的影响[D];广西大学;2013年

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本文编号：475277