解脲支原体MB抗原保守区的基因克

发布时间：2017-06-23 19:15

  本文关键词：解脲支原体MB抗原保守区的基因克隆、表达及其单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：解脲支原体在成年人下生殖道中的定植率为40-80%,通常情况下并不致病,但在一些特定情况下解脲支原体可以引起非淋病性尿道炎、前列腺炎、不孕、早产、胎儿体重偏轻和呼吸道疾病。在过去的50年里,研究者使用动物模型、人体实验、流行病学调查等来分析解脲支原体与这些疾病之间的关系,但并没有得到明确结论。推断解脲支原体相关疾病可能由多种因素引起,患者的免疫力、解脲支原体的种类、抗原变异等因素在疾病的发展过程中可能发挥重要作用。发展一种快速检测解脲支原体感染的方法将极有利于解脲支原体有关疾病的明确诊断和有效防治。本研究通过基因克隆表达获得解脲支原体表面抗原MB保守区,并制备针对MB抗原的特异性抗体,为开发检测解脲支原体的胶体金免疫层析试纸条奠定基础。 研究内容分以下两个部分： 一、解脲支原体MB抗原保守区的原核表达和抗原性分析 为了获得解脲支原体MB抗原保守区,通过EBI在线分析解脲支原体14个血清型MB抗原基因,找出同源性最高的基因片段,此片段含294个碱基序列。为了制备用于免疫小鼠的MB抗原和用于筛选抗体的检测性MB抗原,利用Oligo软件设计了两对引物,用PCR扩增出这段保守基因,分别克隆进pGEX-4T-1和pET-30a载体,得到原核表达载体pGEX-4T-MB和pET-30a-MB。在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达获得37kDa的GST-MB和11kDa的His-MB两种融合蛋白。使用蛋白纯化仪分别纯化这两种融合蛋白,两种融合蛋白的纯化效率分别是92.7%和86.7%。用His-MB融合蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA检测制备的重组蛋白是否有免疫活性。结果显示免疫血清与常用的商品化MB抗原和本研究制备的重组GST-MB均能有效反应,特异性抗体效价在1:6400-1:12800间。同时,多抗血清也能够与血清三型解脲支原体特异性结合。 二、解脲支原体MB抗原单克隆抗体制备 为制备可用于检测解脲支原体表面抗原的单克隆抗体,用第一部分制备的His-MB融合蛋白免疫小鼠,经三次皮下多点免疫和一次尾静脉注射加强免疫后,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA检测融合细胞的培养上清。采用有限稀释法对ELISA检测结果阳性的融合细胞进行克隆化,经三次亚克隆后,获得三株能稳定分泌抗MB McAb的杂交瘤细胞。秋水仙素处理杂交瘤细胞,吉姆萨染色显示杂交瘤细胞的染色体数目在95-105间。三株细胞分别制备腹水,初步检测表明腹水中含有相应抗体,腹水效价在1:320000左右,亚类鉴定结果表明三株单抗的重链均为IgGl, Western-blot结果显示,抗体和融合蛋白GST-MB可以发生特异性结合。以制备的多抗和单抗为一抗,间接ELISA检测50例临床尿液样本,与液体培养法相比,单抗检测的阳性率较低,统计学分析显示P0.05,存在显著差异；而使用多抗检测的准确率与液体培养法相近,P0.05,两种方法无显著差异。
【关键词】：解脲支原体 MB抗原 非淋病性尿道炎 单克隆抗体
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 符号说明4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 文献综述：解脲支原体感染及其诊断技术研究进展10-19
• 一、临床危害10-11
• 二、常规实验室诊断方法11-13
• 三、胶体金免疫层析技术13-15
• 参考文献15-19
• 研究内容一：解脲支原体MB抗原保守区的原核表达和抗原性分析19-30
• 1 材料和方法19-23
• 2 结果23-28
• 3 讨论28-29
• 参考文献29-30
• 研究内容二：解脲支原体MB抗原单克隆抗体制备30-40
• 1 材料和方法30-35
• 2 结果35-37
• 3 讨论37-38
• 参考文献38-40
• 结论40-41
• 附录：本文涉及的主要培养基及其试剂41-48
• 攻读学位期间发表的学术论文48
• 攻读学位期间获奖情况48-49
• 致谢49-50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 林彤;独军政;丛国正;邵军军;高闪电;常惠芸;谢庆阁;;胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展[J];安徽农业科学;2010年16期

  本文关键词：解脲支原体MB抗原保守区的基因克隆、表达及其单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：476055