通过优化Kex2 P1’位点在毕赤酵母中高效表达重组蛋白SCF

发布时间：2017-06-26 00:04

  本文关键词：通过优化Kex2 P1’位点在毕赤酵母中高效表达重组蛋白SCF，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：如今，，重组蛋白的研究已经日趋成熟，各种蛋白表达体系也被不断完善，其中巴斯德毕赤酵母作为经典蛋白表达系统被广泛应用。毕赤酵母具有生长速率高，培养条件简单，毒性小，污染少，分泌出蛋白构象完整，活性高等优点，但其蛋白分泌水平不稳定也成为生产和科研的一大难题。本文针对酵母分泌不稳定的问题，优化了毕赤酵母Kex2P1’位点氨基酸，从而使Kex2切割信号肽的效率明显提高，大量增加毕赤酵母分泌蛋白量。 为了利于筛选出高表达的突变株，本研究将报告基因Luciferase整合到表达载体pPICZαA中，使其与目的基因融合，在适宜的条件下共同表达，从而通过Luciferase报告基因的表达情况，间接标定目的蛋白的表达情况。荧光素酶在ATP，Mg2+，O2存在的下，与特异的荧光素酶底物反应，释放出光子，从而可以通过荧光照度计对荧光值进行定量的检测。由于报告基因Luciferase与目的基因属于融合表达，通过荧光值的高低筛选出高表达的突变株，用于后续的目的基因表达及纯化。 本研究在优化毕赤酵母Kex2P1’位点的基础上，对干细胞因子SCF进行了大量表达及纯化。SCF作为重要的造血干细胞因子，其功能作用主要是通过与e-kit受体相结合，刺激肥大细胞的增殖，协调其他生长因子维持祖细胞、造血细胞存活，对细胞数量集落的增加、定向分化以及粘附起着重要的作用。本文以pPICZα-A作为载体，通过分子克隆手段对pPICZα-A进行改造，优化Kex2P1’位点氨基酸，使SCF大量表达，并通过多步纯化，最后得到活性较高的SCF。
【关键词】：毕赤酵母 Kex2 P1’位点 SCF 表达与纯化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 绪论9-16
• 1.1 大肠杆菌表达体系9-10
• 1.2 毕赤巴斯德酵母10-13
• 1.2.1 毕赤巴斯德酵母载体的基本组成10-11
• 1.2.2 酵母分泌蛋白机制11-12
• 1.2.3 Kex2 的研究进展12-13
• 1.3 干细胞因子（Stem cell factor）研究进展13-14
• 1.3.1 干细胞因子（SCF）生物活性及作用机制13
• 1.3.2 干细胞因子（SCF）结构特点13-14
• 1.4 立题依据14-15
• 实验流程图15-16
• 第2章 Kex2 P1’位点的优化及 SCF 重组蛋白的表达16-48
• 2.1 材料与方法16-32
• 2.1.1 材料16-20
• 2.1.2 实验方法20-32
• 2.2 实验结果32-46
• 2.2.1 酵母重组载体构建及优化过程32-39
• 2.2.2 重组蛋白 SCF 的鉴定39-41
• 2.2.3 重组蛋白 SCF 的纯化41-44
• 2.2.4 SCF 蛋白浓度的测定44
• 2.2.5 重组蛋白 SCF 活力测定44-45
• 2.2.6 SCF 大肠杆菌胞内表达及 Ni 亲和层析纯化45-46
• 2.3 讨论46-48
• 2.3.1 表达载体的选择及改造46
• 2.3.2 报告基因 Luciferase46
• 2.3.3 SCF 的制备46-48
• 第3章 研究总结48-49
• 3.1 本研究实验结果48
• 3.2 本研究的创新之处48
• 3.3 拟进一步的研究方案48-49
• 参考文献49-53
• 作者介绍53
• 已发表论文53-54
• 致谢54

【参考文献】

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本文编号：484015