重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究
发布时间：2017-06-26 19:18
本文关键词：重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：血栓性急性心脑血管病是严重威胁人类健康的疾病。目前在治疗这类疾病方面已经取得了重大进展,溶栓治疗是其中最为重要的技术之一。据世界卫生组织统计,全世界每年死于该类疾病的患者大约有1600万人,我国每年患有这类疾病的人数也有500万人。因此,研发出新的高效的溶栓药物受到越来越多研究机构的重视。 组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)是纤溶系统的生理性激活剂,由于t-PA与血栓基质纤维蛋白有很强的特异性亲和力,能有效地在血栓局部激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。重组t-PA是利用基因工程技术开发出的用于治疗心脑血管病的特效药,与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身的纤维蛋白溶解、疗效高等优点,但是在临床应用中也有很多不足,如在体内可被肝细胞迅速清除,在血浆中存在纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1～5min)使临床溶栓治疗时为维持有效浓度需大剂量(100～150mg),增加了系统性纤溶引起出血的危险。由德国的勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)制药公司生产的瑞替普酶(rt-PA)和阿替普酶(CHO-t-PA),已经成功投放市场用于治疗血栓性疾病。首先它们在体内的半衰期延长到了18min,且增强了与纤维蛋白的结合力,并且还是可逆结合,大大提高了激活纤溶酶原的活性。其次可通过静脉给药,且降低了用药剂量。但是它们的分子结构中有PAI-1的结合位点,血液中的PAI-1与其结合从而抑制纤溶活性。有国外文献报道血栓性疾病患者血中PAI-1浓度高于正常人,体外实验也证实了5U·mL-1的PAI-1可以使5ng·mL-1rt-PA和天然CHO-t-PA失活,所以临床用量仍较高。 因此研制半衰期长且活性不受PAI-1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突变体成为当务之急,本实验室在重组t-PA的基础上使PAI-1位点的碱基突变,去除了指状区、表皮生长因子区和Kringle1区,使含有373-384PAI-1结合位点的rt-PA的基因序列AAG CAC AGGAGG突变为GCG GCC GCG GCG,氨基酸KHRR相应变为AAAA,构建了新的t-PA突变体,并克隆于大肠杆菌表达载体。本研究构建pBV220-t-PA重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5α,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。测序证实t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白30%,比活性为4.2×105IU·mg-1, t-PA突变体与PAI-1反应后其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.3298μmol·L-1,最大水解速度Vmax为0.0476μmol·min-1·g-1。经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。
【关键词】：t-PA突变体 PAI-1 基因克隆 蛋白表达 动力学常数
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：
- 摘要5-7
- ABSTRACT7-9
- 英文缩写9-11
- 前言11-12
- 材料与方法12-27
- 结果27-30
- 附图30-37
- 讨论37-40
- 结论40-41
- 参考文献41-45
- 综述45-57
- 参考文献52-57
- 致谢57-59
- 个人简历59-60
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前8条
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4 江成英;郭宏文;Q，
本文编号：487339
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