铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达

发布时间：2017-06-27 03:04

  本文关键词：铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1 VP22融合基因真核表达质粒的构建与表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimplex virus1，HSV-1)间层蛋白VP22的融合表达的重组质粒，体外转染，观察其在真核细胞中的表达，为进一步研究铜绿假单胞菌DNA疫苗奠定基础。 方法：从铜绿假单胞菌基因组中PCR扩增编码外膜蛋白F的基因序列，然后克隆至真核表达载体pVAX1，构建重组质粒pVAX1-OprF；从重组质粒pcDNA3-VP22中酶切出HSV-1VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pVAX1中，构建重组质粒pVAX1-VP22，利用酶切和序列分析方法验证所构建的载体的正确性。将VP22定向克隆至pVAX1-OprF中，构建pVAX1-VP22-OprF，将OprF定向克隆至pVAX1-VP22中，构建pVAX1-OprF-VP22（由上海生工完成）；同时利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP22蛋白的碳端，然后进行电洗脱得到纯化蛋白，，将纯化的重组VP22蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠获得抗VP22多抗血清，采用Western blot的方法对其特异性进行鉴定。最后，用脂质体法将构建完成的重组质粒转染真核细胞，通过Western blot检测其在真核细胞中的表达情况。 结果：酶切和核酸序列测序证实重组质粒构建完全正确；重组VP22蛋白可在大肠杆菌Rosetta2宿主菌中得到高效表达，得到相对分子质量约30KD的VP22蛋白，纯化的蛋白免疫小鼠后，获得了抗VP22多抗血清。将重组质粒转染真核细胞，Western blot结果证实重组质粒在真核细胞中得到了表达。 结论：成功构建了含有VP22和OprF的双表达载体；建立了HSV-1间层蛋白原核表达系统和成功制备了抗VP22多抗血清；构建的重组质粒可在真核细胞中正确表达，为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了良好的基础。
【关键词】：铜绿假单胞菌 外膜蛋白F VP22 DNA 疫苗
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.991
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 引言10-15
• 实验材料及方法15-29
• 实验结果与分析29-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-46
• 综述：Ⅰ型单纯疱疹病毒 VP22 蛋白的转导功能及其应用46-55
• 参考文献52-55
• 附录55-60
• 个人简历60

【参考文献】

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1 施晓群;孙景勇;倪语星;汪复;朱德妹;胡付品;蒋晓飞;徐英春;张小江;胡云建;艾效曼;杨青;孙自镛;陈中举;贾蓓;黄文祥;卓超;苏丹虹;魏莲花;吴玲;张朝霞;季萍;王传清;王爱敏;张泓;孔菁;徐元宏;沈继录;单斌;杜艳;俞云松;林洁;;2011年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2013年03期

2 汪复;朱德妹;胡付品;蒋晓飞;胡志东;李全;孙自镛;陈中举;徐英春;张小江;王传清;王爱敏;倪语星;孙景勇;褚云卓;俞云松;林洁;徐元宏;沈继录;苏丹虹;卓超;魏莲花;吴玲;张朝霞;季萍;张泓;孔菁;胡云建;艾效曼;单斌;杜艳;;2012年中国CHINET细菌耐药性监测[J];中国感染与化疗杂志;2013年05期

3 李家泰,李耘,王进,中国细菌耐药监测研究组;我国医院和社区获得性感染革兰阴性杆菌耐药性监测研究[J];中华医学杂志;2003年12期

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本文编号：488342