利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒

发布时间：2017-06-28 08:10

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【摘要】：人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41。首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5E4orf6编码区;将HAdV-5E1A增强子克隆至HAdV-41E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE。该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP。pAd41E4EE-GFP经Pme I酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP。经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0ml浓度为8.0×1010 vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×109 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确。本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的。
【作者单位】： 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室;中国医学科学院药物研究所;
【关键词】： 人型腺病毒 病毒载体 反向遗传 Eorf
【基金】：国家自然科学基金项目(31400156) 国家科技重大专项课题(2013ZX10004-101)
【分类号】：R373
【正文快照】： 人腺病毒分为A~G共7个种,包括50多个型。HAdV-41属于腺病毒F组(种),能引起婴幼儿腹泻,又称腹泻腺病毒或肠道腺病毒,具有开发为肠道靶向基因转移载体的潜力。由于体外培养困难,F组腺病毒也被称为难养腺病毒,这阻碍了F组腺病毒用于口服疫苗载体的开发。腺病毒早期基因的表达起到

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