基于分子构象设计构建高活性细胞因子白介素IL-21

发布时间：2017-06-29 03:16

  本文关键词：基于分子构象设计构建高活性细胞因子白介素IL-21，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白介素21(IL-21)是一种可免疫调控多种细胞分化和功能的多效性细胞因子,在体液免疫和细胞免疫中均发挥重要的作用。蛋白质的空间结构是实现其强大生物功能的基础,而残基突变是提高蛋白质活性的有效途径之一。本论文从hIL-21突变体的建立和生物学实验两个方面研究hIL-21突变体,分以下两部分： 1.hIL-21突变体的建立 通过对同源性较高的白介素进行多序列比对、IL-21/IL-21Ra复合物结构进行构象分析以及软件辅助预测来确定突变位点,得到hIL-21的三个突变体。根据野生型(WT) hIL-21结构采用同源模建的方法构建了三个突变体的空间结构,与野生的IL-21相比,发现空间结构没变,说明选择的突变位点以及突变后的氨基酸没有破坏蛋白质空间构象；之后用FoldX来分析突变前后△G的变化,以kcal/mol为单位,结果显示△△G(突变体1、3)0,0AAG(突变体2)0.5；随后对IL-21的三个突变体运用受控分子动力学(SMD)分析每个残基的骨架顺从性,发现IL-21的突变体3中Helix A上"stability patch'数目增加,这与高活性的IL-2的突变体D10及IL-21的突变体hIL-21/hIL-4的SMD分析结果一致,所以推测突变体3与受体结合亲和力增加,活性更高,结合FoldX的分析结果,可认为突变体3是三种突变体中最好的。 2.获得高产量hIL-21突变体蛋白实验条件的优化 通过MODELLER同源模建方法得到hIL-21的三个突变体的结构,为了用实验验证hIL-21突变体的生物活性,本部分选取hIL-21突变体3重组蛋白进行研究。首先对hIL-21突变体3重组蛋白进行表达,利用营养丰富的LB培养基进行细胞培养,短时间就可以获得高细胞密度的大肠杆菌,而且细菌细胞仍处于增长状态,之后将细胞转入无机盐培养基M9中,不断优化其在M9培养基中的培养条件,使菌体在优化过的温度下培养1-1.5h,再加入IPTG诱导蛋白表达,以获得最高表达量的蛋白,以便在后续实验中对目标蛋白进行活性研究。
【关键词】：细胞因子白介素21 突变体 构象分析 SMD 高蛋白产量
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 绪论9-23
• 1.1 研究背景9-12
• 1.2 蛋白质突变相关知识介绍12-20
• 1.2.1 蛋白质的组成12-16
• 1.2.2 影响蛋白质活性的因素16-17
• 1.2.3 提高蛋白质分子活性的策略17-20
• 1.3 同源模建20
• 1.4 用于YASARA的FoldX插件20-21
• 1.5 受控分子动力学模拟(SMD)模拟21
• 1.6 本课题研究思路21-23
• 第二章 IL-21突变体的建立23-35
• 2.1 引言23
• 2.2 确定突变位点23-26
• 2.2.1 序列比对确定突变位点23-24
• 2.2.2 IL-21二元复合物构象分析确定突变位点24-26
• 2.2.3 辅助软件预测突变位点26
• 2.3 同源模建获得IL-21突变体结构26
• 2.4 Foldx分析IL-21突变前后△G的变化26-27
• 2.5 进行受控分子动力学模拟(SMD)27
• 2.5.1 结构准备27
• 2.5.2 SMD模拟实验参数设置27
• 2.6 结果与讨论27-34
• 2.6.1 确定的IL-21三个突变体中的突变位点27-28
• 2.6.2 WThIL-21的空间结构以及同源模建获得的三个突变体的空间构象28-29
• 2.6.3 Foldx分析IL-21突变前后△G的变化29
• 2.6.4 对IL-2和D10的每个残基进行骨架顺从性分析29-30
• 2.6.5 对IL-21及IL-21高效突变体的每个残基进行骨架顺从性分析30-32
• 2.6.6 对设计的三个突变体的每个残基进行骨架顺从性分析32-34
• 2.7 本章小结34-35
• 第三章 hIL-21突变体3的高产量蛋白获得条件的优化35-52
• 3.1 引言35-36
• 3.2 实验流程图36
• 3.3 实验材料36-41
• 3.3.1 质粒和菌株36
• 3.3.2 试剂和仪器36-37
• 3.3.3 主要溶液配方37-41
• 3.4 实验部分41-46
• 3.4.1 E.coli感受态细胞Rosetta(DE3)的制备41
• 3.4.2 质粒的处理和保存41
• 3.4.3 质粒抽提过程41-42
• 3.4.4 转化和预培养42
• 3.4.5 高细胞密度法IPTG诱导hIL-21突变体3重组蛋白的表达42-43
• 3.4.6 SDS-PAGE检测43-44
• 3.4.7 在LB和M9中同时诱导,验证菌体和质粒质量是否完好44
• 3.4.8 LB中诱导温度和IPTG浓度的优化44
• 3.4.9 二次菌落选择44-45
• 3.4.10 M9中氨基酸条件优化45
• 3.4.11 M9培养基pH值优化45
• 3.4.12 M9中诱导温度的优化45-46
• 3.5 结果和讨论46-50
• 3.5.1 高细胞密度法IPTG诱导hIL-21突变体3重组蛋白的表达46
• 3.5.2 在LB和M9中同时诱导,验证菌体和质粒质量是否完好46-47
• 3.5.3 LB中诱导温度和IPTG浓度的优化47
• 3.5.4 二次菌落选择47-48
• 3.5.5 M9中氨基酸条件优化48-49
• 3.5.6 M9培养基pH值优化49-50
• 3.5.7 M9中诱导温度的优化50
• 3.6 本章小结50-51
• 3.7 展望51-52
• 参考文献52-58
• 致谢58

【共引文献】

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