结核病亚单位疫苗LT84的克隆表达与纯化

发布时间：2017-06-29 12:05

  本文关键词：结核病亚单位疫苗LT84的克隆表达与纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：结核分枝杆菌可以在人体内长期处于休眠状态,当人体免疫功能下降时恢复生长活性,引起活动性肺结核,这是结核病难以根治的主要原因。RpfD(复苏因子D)作为一种结核分枝杆菌休眠期分泌的蛋白,其主要作用在于促进休眠状态的细菌复苏,同时它能引起机体较强的免疫应答。作为结核分枝杆菌的特异性抗原之一,RpfD被发现对正处于复苏状态的结核分枝杆菌有较强的免疫活性。本研究在实验室前期筛选的结核亚单位疫苗ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX中融合插入RpfD的编码基因Rv2389c,构建新型结核亚单位多期融合蛋白疫苗ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX(EARMMH, LT84),以改善原有的结核亚单位疫苗的免疫原性,尤其是对复苏期结核分枝杆菌产生免疫作用。 方法：通过对实验室己构建好的重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX加以改造,利用Bgl Ⅱ单酶切位点插入RpfD的编码基因Rv2389c,构建全新的重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;经测序鉴定确认目的基因连接成功后,将重组质粒转入表达载体大肠埃希菌BL21中,选择适宜条件诱导表达重组蛋白LT84。目的蛋白的诱导表达条件为：温度34℃,IPTG终浓度0.5mmol/L,摇床180RPM,诱导时间4h。诱导表达结束后,利用蛋白电泳分析鉴定目的蛋白是否表达。纯化融合蛋白LT84时首先进行盐析,所得沉淀使用PB缓冲液重悬,然后使用GE公司蛋白纯化仪和疏水柱,进行上样蛋白样品的纯化,以获得目的蛋白LT84。得到纯化的蛋白样品后,使用分光光度计测量蛋白样品0D值推算浓度。 结果：构建了重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX;测序鉴定无变异,利用BL21大肠杆菌表达载体在IPTG终浓度0.5mmol/L,34℃,摇床180RPM,诱导时间4h条件下成功诱导表达重组融合蛋白表达于上清之中。使用饱和硫酸铵溶液对目的蛋白进行盐析盐析浓度为2%,时间为12h；盐析所的产物使用蛋白纯化仪和GE healthcare疏水柱纯化,得到纯化的融合蛋白EARMMH(LT84)。经蛋白电泳鉴定后,使用酶标仪测定蛋白样品浓度为0.755mg/ml. 结论：成功构建了重组质粒PET30a-ESAT6-Ag85B-RpfD-Mtp64-Mtb8.4-HspX,并在适宜的条件下诱导表达融合蛋白EARMMH(LT84),使用盐析及疏水层析纯化了获得了目的蛋白,得到浓度为0.755mg/ml的重组融合蛋白EARMMH(LT84),为进一步研究结核亚单位疫苗提供了新疫苗和备选对象。
【关键词】：结核分枝杆菌 亚单位疫苗 RpfD ESAT6-Ag85B-Mtp64-Mtb8.4-HspX
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52;R392.11
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-10
• 中英文词汇对照10-12
• 1. 前言12-15
• 1.1 结核病流行的历史与现况12-13
• 1.2 抗结核疫苗的现况13
• 1.3 生物工程亚单位疫苗的显著优点13
• 1.4 构建多期亚单位疫苗的意义13-15
• 2. 材料与试剂15-18
• 2.1 主要材料15
• 2.2 主要仪器设备15-16
• 2.3 实验试剂16-18
• 2.3.1 培养基16
• 2.3.2 各种活性酶16
• 2.3.3 诱导表达重组蛋白EARMMH(LT84)所需试剂16-18
• 3. 实验方法18-26
• 3.1 重组质粒pET30a-EARMMH(LT84)的构建18-23
• 3.1.1 引物设计与合成19-20
• 3.1.2 目的基因的扩增20-21
• 3.1.3 目的基因片段的单酶切及纯化21
• 3.1.4 载体质粒的单酶切及去磷酸化21-22
• 3.1.5 目的基因片段与载体质粒的连接22-23
• 3.2 感受态细胞的制备23
• 3.3 连接产物转化DH5a感受态细胞23
• 3.4 阳性克隆质粒的筛选与鉴定23-24
• 3.5 重组融合蛋白EARMMH(LT84)的诱导与表达24
• 3.6 重组蛋白EARMMH(LT84)的纯化24-25
• 3.7 蛋白浓度的测定25-26
• 4. 结果26-35
• 4.1 载体质粒提取结果26
• 4.2 目的基因扩增结果26-27
• 4.3 PCR产物纯化结果27
• 4.4 载体质粒单酶切结果27-28
• 4.5 连接前目的基因片段与载体质粒对比28
• 4.6 PCR验证结果28-29
• 4.7 重组质粒pET30a-EARMMH测序结果29-30
• 4.8 阳性单克隆菌落质粒提取结果30
• 4.9 重组蛋白LT84的诱导表达30-32
• 4.10 目的蛋白盐析结果32-33
• 4.11 重组蛋白LT84的纯化33-34
• 4.12 重组蛋白LT84的浓度测定结果34-35
• 5. 讨论35-39
• 5.1 研发新型亚单位疫苗的前景及意义35
• 5.2 亚单位疫苗的优点35-36
• 5.3 亚单位疫苗组成抗原的选取和各自特点36-38
• 5.4 其它类型亚单位疫苗的特点38-39
• 5.5 构建亚单位疫苗LT84的目的39
• 6. 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-60
• 参考文献56-60
• 攻读硕士学位期间参与课题与论文60-61
• 致谢61

【参考文献】

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