小鼠FcRn介导转运禽流感抗原的粘膜免疫研究

发布时间：2017-06-30 09:15

  本文关键词：小鼠FcRn介导转运禽流感抗原的粘膜免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高致病性禽流感不仅对养禽业造成了巨大的经济损失,而且也感染人,严重威胁人类的健康。禽流感病毒主要通过粘膜感染人体,因此预防禽流感最理想的免疫途径就是通过粘膜免疫,因为皮下或肌肉注射一般只引起非常微弱的粘膜免疫反应,而通过粘膜免疫接种模拟了病毒的自然感染途径,可以同时产生有效地局部粘膜免疫反应和全身性的系统免疫反应。鉴于FcRn可以介导IgG跨越粘膜屏障,我们以小鼠为模型设计禽流感H5N1HA1与小鼠IgG Fc片段融合,模拟FcRn介导IgG转运的胞转通路开展了禽流感的粘膜免疫研究。 在本课题组的前期研究中,已构建了原核表达重组质粒KG-HA1, pET-32a-HA1-wFc与杆状病毒真核表达重组质粒pFASTBAC HTb-sHA1-wFc和pFASTBAC HTb-sHA1-mFco HA1-wFc是HA1和IgG2a Fc野生型片段的融合基因,sHA1-wFc是加了信号肽的HA1和IgG2a Fc野生型片段的融合基因,sHA1-mFc是sHA1和IgG2a Fc突变型片段的融合基因。 本研究主要成果如下： 1.表达并纯化了四种HA1融合蛋白：GST-HA1, His-HA1-wFc(原核表达),His-sHA1-wFc(真核表达,简称sHA1-wFc)和His-sHA1-mFc(真核表达,简称sHA1-mFc)。其分子量分别为62KDa,87KDa,72KDa和72KDa。 2.在IMCD-rFcRn细胞系的体外胞转模型中,FcRn能介导sHA1-wFc融合蛋白从细胞的顶端侧转运到基底膜端侧,而sHA1-mFc融合蛋白和His-HA1-wFc融合蛋白均不能被胞转；在体内sHA1-wFc融合蛋白能有效的跨越小鼠呼吸道粘膜上皮进入血液中,与sHA1-mFc和GST-HA1融合蛋白进入小鼠血液中的量相比差异极显著(P0.01)。 3. sHA1-wFc融合蛋白经滴鼻免疫既能诱导有效的粘膜免疫反应,又能诱导全身性免疫反应：(1)二免后第10d在sHA1-wFc滴鼻免疫组小鼠的气管与肺脏冲洗液中,SIgA的ELISA抗体效价分别为1：117和1：64,IgG的ELISA抗体效价分别为1：298和1：462,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P0.01)。而sHA1-wFc皮下免疫组SIgA的ELISA抗体效价分别仅为和1：10和1：13,IgG的ELISA抗体效价均为1：58。sHA1-wFc滴鼻免疫组与皮下免疫组相比差异极显著(P0.01)。用HI法没有检测到IgG抗体效价。(2)二免后第14d sHA1-wFc滴鼻免疫组IgG的ELISA抗体和HI抗体水平最高,ELISA抗体效价达到1：9386,HI抗体效价达到1：46,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P0.01)；同样,在二免后第14d sHA1-wFc皮下免疫组IgG的ELISA抗体和HI抗体水平最高,ELISA抗体效价达到1：18773,HI抗体效价达到1：80,与sHA1-wFc滴鼻免疫组相比差异极显著(P0.01)。(3)二免后第10d sHA1-wFc滴鼻免疫组血清中IFN-γ和IL-2含量分别达到330pg/mL和106pg/mL,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P0.01)。sHA1-wFc皮下免疫组血清中IFN-γ和IL-2含量分别达到178pg/mL和72pg/mL, sHA1-wFc滴鼻免疫组与皮下免疫组相比差异极显著(P0.01)。(4)二免后第10d sHA1-wFc滴鼻免疫组小鼠脾细胞增殖指数为1.14,与其它滴鼻免疫组差异极显著(P0.01)。sHA1-wFc皮下免疫组小鼠脾细胞增殖指数为1.36,与sHA1-wFc滴鼻免疫组相比差异显著(P0.05)。(5)攻毒后第3d在sHA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)的肺脏中均未检测到病毒的血凝活性,而在其它免疫组肺脏组织中均检测到了病毒的血凝活性；HA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)体重下降不明显,且很快恢复到正常体重,而其它免疫组小鼠体重下降明显,下降幅度最高达25%；sHA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)攻毒保护率均为100%,而sHA1-mFc和His-HA1-wFc滴鼻免疫组小鼠保护率分别仅为40%和20%,空白对照组小鼠全部死亡。 sHA1-wFc融合蛋白辅以CpG ODN1826粘膜佐剂通过滴鼻免疫,利用FcRn介导的IgG胞转通路能有效的转运禽流感抗原跨越小鼠呼吸道粘膜屏障进入体内,既能诱导有效的粘膜免疫反应,又能诱导全身性免疫反应,能完全保护免疫小鼠抵抗致死性禽流感病毒的攻击。
【关键词】：H5N1HA1 sHA1-wFc FcRn 滴鼻免疫 IgG胞转作用
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392;S852.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语表10-12
• 1 文献综述12-22
• 1.1 粘膜免疫12-14
• 1.1.1 粘膜免疫系统12
• 1.1.2 粘膜组织中抗原的转运12-13
• 1.1.3 SIgA在粘膜免疫中的作用13
• 1.1.4 粘膜佐剂13-14
• 1.2 FcRn的研究进展14-18
• 1.2.1 FcRn的发现14-15
• 1.2.2 FcRn的结构15-16
• 1.2.3 FcRn与IgG的相互作用16-17
• 1.2.4 FcRn的胞转功能17-18
• 1.2.5 FcRn的应用18
• 1.3 禽流感疫苗的研究进展18-22
• 1.3.1 禽流感18
• 1.3.2 禽流感病毒的结构18-19
• 1.3.3 凝素蛋白(HA)19
• 1.3.4 禽流感的公共卫生学意义19-20
• 1.3.5 人用禽流感疫苗研究进展20-22
• 2 目的意义22-23
• 3 材料方法23-40
• 3.1 材料23-27
• 3.1.1 菌株、细胞、毒株、鸡胚及实验动物23
• 3.1.2 质粒与杆粒23
• 3.1.3 主要药品与试剂23
• 3.1.4 主要仪器23-24
• 3.1.5 各种培养基的配制24
• 3.1.6 主要试剂的配制24-27
• 3.2 实验方法27-40
• 3.2.1 重组原核表达质粒的诱导表达及鉴定27-29
• 3.2.2 原核表达蛋白的纯化29-30
• 3.2.3 重组真核表达质粒的诱导表达及鉴定30-33
• 3.2.4 HA1融合蛋白的血凝活性测定33
• 3.2.5 HA1融合蛋白的体外胞转实验33-34
• 3.2.6 HA1融合蛋白跨越小鼠呼吸道粘膜屏障的检测34
• 3.2.7 滴鼻和皮下免疫效果的检测34-40
• 4 结果40-52
• 4.1 蛋白的原核表达与鉴定40-42
• 4.1.1 GST-HA1融合蛋白的原核表达与鉴定40
• 4.1.2 His-HA1-wFc融合蛋白的原核表达及鉴定40-41
• 4.1.3 sHA1-wFc与sHA1-mFc融合蛋白的真核表达及鉴定41-42
• 4.2 蛋白的纯化与鉴定42-44
• 4.2.1 GST-HA1融合蛋白的纯化及鉴定42-43
• 4.2.2 His-HA1-wFc融合蛋白的纯化及鉴定43
• 4.2.3 sHA1-wFc与sHA1-mFc融合蛋白的纯化及鉴定43-44
• 4.3 HA1融合蛋白的血凝活性检测44
• 4.4 HA1融合蛋白的体外胞转实验44-45
• 4.5 HA1融合蛋白跨越小鼠呼吸道粘膜屏障的检测45-46
• 4.6 滴鼻与皮下免疫小鼠结果46-52
• 5 讨论52-56
• 5.1 FcRn的作用52-54
• 5.2 CpG粘膜佐剂54
• 5.3 粘膜免疫疫苗54-56
• 6 结论56-57
• 参考文献57-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 张林波;粘膜佐剂的研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2003年04期

2 金宁一,郭建顺;禽流感的流行及其防制[J];解放军医学杂志;2004年02期

3 何后军,戴益民,付光华;禽流感病毒分子生物学研究进展[J];江西农业大学学报(自然科学);2004年02期

4 李伟毅;粘膜免疫[J];上海免疫学杂志;1994年02期

5 张然,徐慰倬,孔平,许红韬,李宁;转基因动物应用的研究现状与发展前景[J];中国生物工程杂志;2005年08期

6 张永振,徐建国;粘膜免疫系统与粘膜免疫应答的诱导[J];细胞生物学杂志;2001年01期

  本文关键词：小鼠FcRn介导转运禽流感抗原的粘膜免疫研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：501375