日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

发布时间：2017-07-01 20:18

  本文关键词：日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血吸虫病(Schistosomiasis)至今仍然是一个全球性公共卫生问题,数以百万计的人受其威胁。主要是由血吸虫(Schistosome)尾蚴感染而引起的一种寄生虫病。血吸虫病的防治方法仍然以吡喹酮的给药治疗为主,但是目前已有报道长期使用吡喹酮可以诱导产生抗药性。因此目前发展高效、安全的疫苗是持续控制血吸虫病的一种理想的研究方向。细胞凋亡是由多基因严格控制的细胞程序性死亡。细胞凋亡对维持生物体正常的生长发育以及内环境的稳定具有重要作用。本课题组前期的研究表明,不同适宜性宿主来源的日本血吸虫童虫在形态、发育以及虫体细胞凋亡现象方面都存在显著的差别,推测细胞凋亡可以影响日本血吸虫虫体的生长发育。BAD 是 Bcl-2 相关的死亡启动子(bcl-2 associated death promoter),.属于 Bcl-2家族的促凋亡基因,仅含有BH3。本文SjBAD的基因序列来自欧洲分子生物学实验室数据库(EMBL,http://www.ebi.ac.uk/),基因编号为 SjD AY814710.1,设计特异引物,选用42d虫体cDNA为模板。PCR扩增,克隆了日本血吸虫SjBADORF编码的部分基因,长度为594bp,编码197个氨基酸。选用pET-28a(+),构建了重组表达质粒pET-28a(+)-SjBAD,并将其转化到大肠杆菌BL21中,成功诱导了重组蛋白pET-28a(+)-SjBAD,分子质量约为27kDa。实时定量PCR分析表明SjBAD基因在日本血吸虫虫体的各个发育阶段均有转录,在14d虫体中表达量最高,随后随着虫体的生长,相对表达量逐渐降低,在42d雄虫的表达量高于雌虫。Western blotting分析表明重组SjBAD具有较好的抗原性和免疫原性。间接ELISA分析表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性IgG抗体。动物免疫试验表明,同PBS对照组相比较,重组蛋白SjBAD在BALB/c小鼠体内诱导了 27.50%和33.57%的减虫率,及39.80%和42.06%的肝脏虫卵减少率,差异都非常显著。成功构建了真核重组质粒pcDNA3.1(+)-SjBAD,并将其转染到293T细胞中,实时定量PCR检测表明SjBAD在转染293T细胞36h表达量最高,流式细胞术检测表明日本血吸虫促凋亡基因SjBAD能够促进293T细胞凋亡。本文为深入开展SjBAD的生物学功能研究,及筛选针对SjBAD的药物靶标提供了基础。
【关键词】：日本血吸虫 细胞凋亡 BAD
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-9
• 英文缩略词表9-11
• 前言11-12
• 第一篇 绪论12-22
• 第一章 文献综述12-22
• 1 血吸虫病与血吸虫的生活史12-13
• 1.1 血吸虫病12
• 1.2 血吸虫的生活史12-13
• 2 细胞凋亡概述13-14
• 2.1 细胞凋亡与死亡13
• 2.2 哺乳动物细胞凋亡的三种途径13-14
• 3 Bcl-2蛋白家族和BAD蛋白14-15
• 3.1 Bcl-2蛋白家族14
• 3.2 BAD蛋白14-15
• 4 血吸虫细胞凋亡的研究进展15
• 5 细胞凋亡的检测15-16
• 5.1 形态学的检测15
• 5.2 DNA断裂检测分析15-16
• 5.3 凋亡相关因子的检测16
• 5.4 流式细胞仪分析(flow cytometry assay,FCA)检测细胞凋亡16
• 6 本研究的总体研究思路16-17
• 参考文献17-22
• 第二篇 试验研究22-62
• 第二章 日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的原核克隆表达及免疫保护效果评估22-48
• 1 材料与方法22-35
• 1.1 实验材料22-27
• 1.2 实验方法27-35
• 2 试验结果35-44
• 2.1 日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的克隆表达及生物信息学分析35-37
• 2.2 Real-time PCR检测SjBAD在不同时期日本血吸虫虫体内的转录水平37-38
• 2.3 重组质粒pET-28a(+)-SjBAD的构建及鉴定38-39
• 2.4 重组蛋白SjBAD的表达与分析39-41
• 2.5 Western blotting检测重组蛋白SjBAD的抗原性和免疫原性41-42
• 2.6 重组蛋白SjBAD免疫保护效果评估42-43
• 2.7 ELISA检测重组蛋白SjBAD诱导小鼠体内产生的特异性IgG抗体水平43-44
• 3 讨论44-45
• 参考文献45-48
• 第三章 日本血吸虫促凋亡基因SjBAD真核克隆表达及相关功能研究48-62
• 1 材料与方法48-54
• 1.1 实验材料48-50
• 1.2 试验方法50-54
• 2 试验结果54-60
• 2.1 日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的扩增54-55
• 2.2 构建与鉴定真核表达重组质粒pMD-19T-SjBAD55-56
• 2.3 真核重组质粒pcDNA3.1(+)-SjBAD的构建与鉴定56-57
• 2.4 293T细胞的培养57
• 2.5 荧光实时定量PCR检测SjBAD在293T细胞内不同时期的转录水平57-58
• 2.6 细胞流式术检测日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的作用58-60
• 3 讨论60-61
• 参考文献61-62
• 全文总结62-64
• 致谢64-66
• 论文发表情况66

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